ПЦР( полимеразная цепная реакция)

4. ПЦР( полимеразная цепная реакция)

ПЦР- это экспериментальный метод молекулярной биологии, который позволяет увеличить концентрацию нужных фрагментов ДНК и РНК в биологическом материале. Это специфическая амплификация нуклеиновых кислот, осуществляемая in vitro и инициируемая синтетическими олигонуклеотидными праймерами.

Механизм ПЦР

Компоненты реакционной смеси:

● Праймеры– это олигонуклеотиды, синтезированные искусственно и имеющие небольшой размер (от 15 до 30 нуклеотидных остатков), которые идентичны участкам ДНК.

● Taq-полимераза – термостабильная ДНК-полимераза , преимуществом которой является способность работать при повышенных температурах (72-80 ᵒС). Он обеспечивает достраивание 3’-конца второй цепи ДНК по принципу комплементарности.

● Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - нуклеотиды, используемые Taq-полимеразой в качестве строительного блока при синтеза второй цепи ДНК.

● Буфер – обеспечивает постоянное значение pH и оптимальные условия для протекания реакции.

● Анализируемый образец – подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, служащую мишенью для многократного копирования. Если этого образца нет в смеси,то реакция амплификации проходить не может из-за отсутствия матрицы для образования копий ДНК.

Этапы амплификации:

● Денатурация - в эту стадию происходит разделение матричной ДНК на отдельные цепи. При этом происходит разрыв водородных связей между комплементарными парами оснований. Температура денатурации устанавливается в пределах 94°-96° С и зависит от содержания GC связей ( так как они наиболее прочные);

● Связывание (отжиг) праймеров – в эту стадию происходит специфическое связывание (отжиг) праймера с комплементарной ему частью одноцепочечной матричной ДНК. Праймеры при этом должны быть комплементарны противоположной цепи, иначе отжиг осуществляться не будет.

● Элонгация (удлинение) праймеров при синтезе ДНК – в эту стадию происходит удлинение праймеров на матричной последовательности в соответствии с принципом комплементарности исходной и синтезируемой цепей. Процесс происходит с участием фермента термостабильной Taq-полимеразы. Оптимальная температура - 72° С. Время этого этапа обычно определяется по длине ДНК, которое необходимо получить. Taq-полимераза движется в направлении от 3’ к 5’- концу.

Результатом этого циклического процесса является многократное увеличение количества необходимого фрагмента ДНК. Количество копий ДНК увеличивается в геометрической прогрессии. Цикл реакций денатурации матрицы, отжига и удлинения праймеров повторяется 25-35 раз.

При выполнении данной работы необходимо сначала развести праймеры в 10 раз (начальная концентрация указана на пробирке). Затем надо приготовить микс из прямого (forward) и обратного (reverse) праймеров: в отдельную пробирку внести по 15 мкл forward и reverse и долить воды mQ до 500 мкл.

Этапы полимеразной цепной реакции (рис.1)

Далее мы готовим реакционную смесь:

реагент	Объём (мкл) для одной пробы
mQ
Gold
DNA
Pr

Буфер для ПЦР готовят следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 2.5 мМ MgCl2

Помещали образцы в термоциклер (амплификатор) CFX Real-Time PCR Systems (Bio-Rad).

Выводы:проходя практику в лаборатории молекулярно-генетической диагностики, я освоила некоторые биохимические методы: выделение ДНК из цельной крови набором; метод фенол-хлороформной экстракции ДНК из сухих пятен крови, высушенных на фильтровальной бумаге; электрофорез в агарозном геле; некоторые этапы постановки ПЦР-реакции.

⇐ Предыдущая 1 2 34