Выделение ДНК из цельной крови набором

ГБОУ ВПО РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И.ПИРОГОВА МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РОССИИ

Кафедра биохимии

Отчёт

о прохождении лабораторной практики в Лаборатории молекулярно-генетической диагностики НЦЗД РАМН(заведующий лабораторией: Савостьянов Кирилл Викторович)

Выполнила:

Студентка МБФ отделения «Медицинская биохимия»

Дариенко Кристина, 382 гр.

Научный руководитель от лаборатории:

Кандидат биологических наук

Пушков Александр Алексеевич

Руководитель практики от университета:

Профессор, кандидат биологических наук

Добрынина Ольга Васильевна

Москва, 2015

Я проходила практику в Лаборатории молекулярно-генетической диагностики НЦЗД РАМН. Во время прохождения практики я освоила некоторые экспериментальные методы, занимающие одно из центральных мест в биохимических исследованиях.

Одним из самых важных объектов биохимического исследования является ДНК, и для начала её нужно получить. ДНК можно выделить из крови, различных биологических жидкостей. В лаборатории меня научили получать её из крови двумя способами: из цельной крови методом набора и из сухих пятен крови методом фенол-хлороформной экстракции ДНК.

1. Выделение ДНК из цельной крови набором

Первый способ - выделение ДНК из цельной крови набором. Суть метода заключается в том, чтобы избавиться от плазмы крови и всех компонентов кровяных клеток, кроме ядерной ДНК. Таким образом, мы получаем чистый препарат ДНК, необходимый для различных генетических исследований и для выявления у пациента ряда генетических заболеваний, таких, как болезнь Помпе, болезнь Гоше, болезнь Фабри. Также, полученная ДНК может быть пригодна для проведения амплификации.

Необходимые материалы и оборудование:

● Протеиназа К, раствор (20 mg/ml);

● RNase,раствор (20 mg/ml);

● Буферный раствор (SDS или другой);

● Этанол 96%;

● Wash Buffer 1 (Genomic);

● Wash Buffer 2 (Genomic);

● Genomic Elution Buffer;

● Пробирки типа Eppendorf объёмом 1,5 мл;

● Пробирки типа Spin Column с абсорбентом;

● Пробирки типа Spin Column объёмом 1,5 мл;

● Пробирки типа Collection Tube.

В лаборатории, согласно технике безопасности, необходимо работать в застёгнутом халате, перчатках; процедуры проводить в вытяжном шкафу!

Протокол выделения ДНК из цельной крови набором:

1. В пробирки, объёмом 1,5 мл, внести по 200 мкл цельной крови; предварительно на пробирках написать регистрационные номера пациентов.

2. Добавить по 20 мкл протеиназы К (фермента, предназначенного для расщепления, денатурации белков плазмы крови и белков кровяных клеток).

3. Добавить по 20 мкл RNase (фермента, катализирующего деградацию РНК).

4. Тщательно перемешать содержимое пробирок в мини-центрифуге-вортекс (она нужна для равномерного распределения ферментов в объёме крови, а также для мягкого и интенсивного перемешивания реагентов).

5. В пробирки добавить по 200 мкл лизирующего буфера ( который осуществляет расщепление мембран всех клеток крови и одновременно поддерживает необходимое pH среды для протекания реакции.)

6. Смесь всех реагентов с кровью в пробирках поставить в термостат (аппарат, обеспечивающий поддержание постоянной температуры) на 10 минут при 55 ᵒС.

7. По истечении 10 минут в пробирки долить по 100 мкл этанола 96%.

8. В пробирки с абсорбентом (Spin Column) внести по 640 мкл крови из первоначальных пробирок. Пробирки с абсорбентом (веществом, способным поглощать, всасывать из раствора другие вещества и образовывать с ним связи) используют для получения чистого материала ДНК. Такой абсорбент задерживает ДНК и пропускает остальные компоненты крови, которые в нашем случае являются балластными.

9. Центрифугировать Spin Column в течении 1 минуты на максимальной скорости 14000 об/мин. При центрифугировании происходит осаждение на дно пробирки всех балластных веществ.

10. Перенести из Spin Column верхнюю часть с абсорбентом в пробирки без абсорбента

( Collection Tube) и добавить по 500 мкл промывочного буфера Wash Buffer 1 (Genomic) для очистки ДНК от возможного загрязнения ненужными нам компонентами крови.

11. Центрифугировать в течении 1 минуты на максимальной скорости 14000 об/мин.

12. Перенести из Collection Tube верхнюю часть с абсорбентом в новые пробирки Collection Tube и добавить по 500 мкл промывочного буфера Wash Buffer2 (Genomic).

13. Центрифугировать в течении 3-х минут на максимальной скорости 14000 об/мин. Перенести из Collection Tube верхнюю часть в Spin Column на 1,5 мл.

14. Добавить по 100 мкл Genomic Elution Buffer ( осуществляющет более высококачественную очистку, после которой ДНК оказывается на дне пробирки в буферном растворе.)

15. Центрифугировать в течении 1 минуты на максимальной скорости 14000 об/мин.

16. Выкидываем верхнюю часть, нижнюю оставляем( в ней остался раствор ДНК).

После выделения ДНК из крови, я мерила её оптическую плотность на капельном спектрофотометре. Для начала спектрофотометр необходимо обнулить. Веществом, у которого оптическая плотность принимается за ноль, считается вода. Мерить оптическую плотность ДНК в растворе надо относительно оптической плотности воды. Оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации ДНК в растворе.

12 3 4 Следующая ⇒