Электрофорез

3. Электрофорез

Другой экспериментальный метод, который я освоила на практике - гель-электрофорез.

Гель-электрофорез – метод разделения смеси молекул ДНК по размеру, применяется для очистки ДНК, анализа ДНК-продуктов, полученных в результате ПЦР, разделения фрагментов ДНК. Он основан на том, что молекулы ДНК в буферном растворе заряжены отрицательно и под действием электрического поля движутся к положительно заряженному полюсу-аноду. Обычно электрофорез проводится в агарозном или полиакриламидном геле. Эти гели имеют пористую структуру и обладают эффектом сита, в результате чего большие молекулы задерживаются в порах и медленнее движутся к аноду, а меньшие молекулы движутся быстрее. Разделяющая способность геля зависит от размера пор, который, в свою очередь, зависит от концентрации геля.

Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, Тris - гидроксиметиламинометан (для растворения нуклеиновых кислот), а также борную или уксусную кислоты. Соответственно, буфер, содержащий борную кислоту, называется TBE (tris-borate-EDTA), а буфер, содержащий уксусную кислоту TAE (tris-acetate-EDTA).

В нашей работе разделение молекул ДНК по молекулярной массе проводили с помощью горизонтального агарозного 1,5% геля. Он готовится на основе ТАЕ или ТBЕ буфера. К 1,5 гр агарозы добавляется 100 мл буфера и доводится до полного растворения в микроволновой печи. После этого в полученный жидкий гель добавляется 8-10 мкл бромистого этидия (интеркалирующего агента) на 100 мл продукта для последующего проявления в ультрафиолете. Гель быстро заливается в приготовленную плашку и инкубируется в течение получаса до полного охлаждения. После приготовления геля, в нём с помощью гребёнки формируют лунки для внесения образцов молекул ДНК. Электрофорез проводят при постоянной силе тока в 400 мА с использованием камеры для горизонтального гель-электрофореза. Время проведения - 20-30 минут. Так же в каждую лунку вносят каплю красителя бромфенолового синего для визуального контроля миграции молекул ДНК. Каждая полоса на геле соответствует отдельному фрагменту ДНК. В начале будут находиться фрагменты с большей, а в конце с меньшей молекулярной массой. После проведения этой процедуры гель помещают на трансиллюминатор, который излучает свет в ультрафиолетовом диапазоне. Энергия ультрафиолета, поглощаемая молекулой ДНК, передаётся на молекулу красителя (бромистого этидия), заставляя его флуоресцировать. Таким образом оценивают результат.

Это метод разделения белков, основанный на их способности двигаться в электрическом поле. Это метод, позволяющий разделить смесь заряженных белков за счёт различий их масс и зарядов.

⇐ Предыдущая 1 234 Следующая ⇒