Выделение геномной ДНК из сухих пятен крови

2. Выделение геномной ДНК из сухих пятен крови

Вторым методом выделения геномной ДНК является метод фенол-хлороформной экстракции ДНК из сухих пятен крови, высушенных на фильтровальной бумаге. Здесь в качестве лизирующего буфера используется SDS-буферный раствор. В его состав, помимо прочих компонентов, входит 2-меркаптоэтанол, который восстанавливает дисульфидные связи белка и тем самым осуществляет его денатурацию, и додецилсульфат натрия (SDS) - детергент, способный связывать белки и позволяющий, таким образом, избавиться от них.

Необходимые материалы и оборудование:

● Протеиназа К, раствор (20 mg/ml);

● Фенол;

● Хлороформ;

● Этанол 70%;

● Изопропиловый спирт;

● Лизирующий SDS – буфер;

● Вода для молекулярной биологии;

● Пробирки типа Eppendorf объёмом 1,5 мл.

Протокол выделения ДНК из цельной крови набором:

1. Вырезать ножницами с тест-бланка одно пятно крови и поместить его в пробирку объёмом 1,5 мкл.

2. Добавить 400 мкл лизирующего буфера SDS и 20 мкл протеиназы К (для лизиса клеточных мембран и лизиса всех белков.)

3. Тщательно перемешать содержимое пробирок, поместив их в мини-центрифугу-вортекс и поставить инкубировать на 1,5 час при 300 об/мин и 65 ᵒС.

4. Добавить к лизату клеток 400 мкл фенола, тщательно перемешать и центрифугировать 10 минут при 14000 об/мин.

5. Верхнюю фазу отобрать в новую пробирку, добавить равный объём смеси фенол/хлороформ (1:1) - по 200 мкл; тщательно перемешать и центрифугировать на протяжении 10 минут при 14000 об/мин.

6. Верхнюю фазу отобрать в новую пробирку, добавить 400 мкл хлороформа, тщательно перемешать и центрифугировать 10 минут при 14000 об/мин.

7. Верхнюю фазу отобрать в новую пробирку добавить 400 мкл изопропилового спирта и 15 мкл NaCl (5M), тщательно перемешать и поместить в морозильную камеру при -70 ᵒС на 15 минут.

8. Центрифугировать 20 мин при 14000 об/мин.

9. Удалить супернатант, к осадку добавить 200 мкл 70% этанола и центрифугировать 5 минут при 14000 об/мин.

10. Удилать супернатант, осадок высушить в вакуумной центрифуге при 30 ᵒС в течение 5 минут.

11. К осадку добавить 80 мкл воды для молекулярной биологии и аккуратно перемешать.

Фенол-хлороформную смесь используют для экстрагирования белков. Фенол и хлороформ-органические растворители. Поскольку их плотности отличны от плотности буфера, после центрифугирования лизата клеток и добавления фенола и хлороформа, образуется 2 слоя: нижний, который представляет собой раствор из органических растворителей, и верхний-буферный раствор. Во время центрифугирования белки постепенно денатурируют и преципитируют в виде узкой полоски на границе двух фаз. В верхней фазе в буферном растворе остаётся ДНК. Поэтому каждый раз мы отбираем именно верхнюю фазу, проделывая этот этап несколько раз для более высокой очистки ДНК. От всего, что остаётся ниже верхнего слоя, можно избавиться, так как это белки и остальные компоненты крови.

Спирт используется для осаждения на дно пробирки чистого материала ДНК, который остаётся в виде осадка, а верхняя жидкая часть (супернатант) подлежит удалению. В конце концов, после удаления супернатанта остаётся лишь сухой остаток ДНК на дне пробирки. К этому остатку необходимо добавить воду, чтобы получить водный раствор ДНК и померить его оптическую плотность.

После выделения ДНК из сухих пятен крови, нужно померить её оптическую плотность на капельном спектрофотометре.

⇐ Предыдущая 123 4 Следующая ⇒