3.2. ПРОФИЛАКТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 2 страница

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 4Следующая ⇒

3. Препарат " толстая капля", приготовленный непосредственно на предметном стекле, маркируют на полоске крови.

4. Препарат " толстая капля" на подкладке маркируют по мазку, не задевая каплю.

5. " Тонкий мазок" маркируют в толстой части (не следует делать надпись вдоль всего мазка).

6. 4. 4. Фиксация " тонких мазков"

1. Фиксацию мазков проводят в этиловом спирте 96% - 10 мин. или в смеси Никифорова - 20 мин.

2. Мазки погружают и извлекают из фиксирующей жидкости пинцетом.

Препараты по окончании фиксации высушивают на воздухе.

┌ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ┐

│ Препарат " толстая капля" не фиксируют! │

└ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ┘

При длительном хранении (особенно в жарком климате) неокрашенных " толстых капель" может произойти их аутофиксация. При необходимости хранения " толстых капель" для предотвращения аутофиксации препараты до окраски следует обработать забуференным раствором метиленового синего (1 г метиленового синего + 3 г Na2HPO4 + 1 г KH2PO4 + 300 мл дистиллированной воды). " Толстую каплю" после высыхания погружают в этот раствор на 1 секунду, промывают водой и высушивают. В таком виде каплю можно хранить длительное время. Перед исследованием окрашивают по Романовскому меньше, чем обычное время - в течение 6 - 10 минут.

6. 5. Окраска препаратов крови

Одним из основных условий правильной паразитологической диагностики малярии является качественная окраска препаратов крови.

6. 5. 1. Приготовление рабочего раствора краски Романовского - Гимза

Для окрашивания препаратов крови используется 5% или 10% водный рабочий раствор краски Романовского - Гимза.

1. Маточный раствор краски Романовского - Гимза (промышленного изготовления или приготовленный из сухой краски) перемешать и обязательно профильтровать.

2. Приготовить 5-процентный (10-процентный) рабочий раствор краски: к 95 (90) мл буферного раствора добавить 5 (10) мл маточного раствора краски, что соответствует 1 - 2 каплям краски на 1 мл раствора.

3. Готовый рабочий раствор перемешать.

4. При необходимости ускорения получения ответа можно использовать 20-процентный раствор, сократив время окраски до 15 - 20 мин.

┌ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ┐

│ Рабочий раствор для окраски препаратов крови использовать│

│ только свежеприготовленный! │

└ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ┘

Качество каждой новой серии краски необходимо оценить. С этой целью производят пробную окраску препаратов " тонкого мазка" и " толстой капли" крови от здорового человека (если нет крови с малярийными паразитами). Концентрацию рабочего раствора и время окрашивания можно подобрать самостоятельно, т. к. они зависят от качества исходного раствора краски и от температуры окружающей среды.

Показатели качественного окрашивания. Правильно окрашенный препарат макроскопически имеет синий цвет с сиреневым оттенком, а при его микроскопии:

- ядра лейкоцитов фиолетово - красного цвета с различимой структурой;

- зернистость базофилов фиолетового цвета;

- зернистость эозинофилов красного цвета;

- у моноцитов на фоне серо - голубой цитоплазмы может быть розовая зернистость;

- зрелые эритроциты - розового цвета с сероватым оттенком;

- ретикулоциты - сиренево - голубые;

- тромбоциты - сиренево - розового цвета с различимой сетчатостью.

Иногда в промышленных сериях маточного раствора краски Романовского недостаточно азура, что обусловливает слабое окрашивание азурофильных элементов (ядер малярийных паразитов и лейкоцитов, зернистости пораженных эритроцитов и лейкоцитов). Результаты окрашивания мазков и капель могут быть значительно улучшены при добавлении к рабочему раствору краски Романовского так называемой синьки Мансона, которую готовят впрок следующим образом: 1, 5 г метиленового синего и 2, 5 г буры растирают в ступке и добавляют к 100 мл дистиллированной воды. Для созревания флакон с краской оставляют на 10 - 12 дней при комнатной температуре. Процесс созревания можно ускорить, поместив флакон на водяную баню на 40 - 60 мин. при 60 - 80°.

┌ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ┐

│ Раствор не кипятить! │

└ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ┘

Синька Мансона при хранении в темном сухом месте пригодна к использованию в течение многих лет. Количество краски Мансона, добавляемое к рабочему раствору краски Романовского, устанавливают опытным путем: нередко достаточно добавить к 1 л рабочего раствора несколько капель краски.

6. 5. 2. Способы окрашивания и промывки " тонкого мазка" и " толстой капли" по Романовскому - Гимза

Окрашивание препаратов крови можно проводить двумя способами.

1. Препараты крови вертикально помещают в специальные ванночки или контейнеры, без соприкосновения друг с другом. Затем наливают рабочий раствор краски. Данный способ наиболее приемлем, когда есть необходимость окраски большого количества препаратов крови. В стандартном контейнере можно окрасить 20 препаратов при вместимости 90 мл краски. Повторно использовать краску не следует.

2. Препараты располагают горизонтально (мазками вверх) на стеклянных рельсах, лежащих на кюветах. Осторожно пипеткой, так чтобы краска полностью покрывала мазок или толстую каплю, наносят краску. Этот способ чаще применяют при окрашивании небольшого количества препаратов крови. Расход краски составляет примерно 4 мл на 1 препарат.

Данный способ окраски требует тщательной фильтрации маточного раствора краски, т. к. есть вероятность выпадения осадка на препарат крови, что приведет к трудности в диагностике кровепаразитов при микроскопии.

Время окрашивания зависит от температуры окружающей среды. При температуре 20 - 23° " тонкий мазок" окрашивают 40 - 50 мин., " толстую каплю" - 20 - 25 мин. При более низкой температуре время окрашивания увеличивают. При очень высокой температуре (около 30°) время окрашивания капель, но не мазков, может быть сокращено до 15 мин. " Толстые капли", предварительно обработанные забуференным раствором метиленового синего, окрашивают 6 - 10 мин.

│ При подозрении на малярию препараты крови помечаются " CITO! ". │

│ Окрашиваются и исследуются немедленно. │

Ошибки при окраске препаратов крови и способы их устранения приведены в табл. 1 Прилож. 1.

Способ промывки " тонких мазков", фиксированных до окраски, - под струей проточной воды, из пипетки или погружением в емкость - не имеет значения, важно только не обесцветить препарат.

При промывке " толстых капель", особенно свежеприготовленных, необходима осторожность, т. к. капли могут оторваться от стекла. Препарат медленным движением погружают в емкость с дистиллированной водой 1 - 2 раза.

6. 6. Микроскопия окрашенных препаратов крови

Препараты крови исследуют под микроскопом с применением масляной иммерсии: объектив x90 или x100, окуляр x7.

Сначала микроскопируют " толстую каплю", затем для уточнения вида возбудителя - " тонкий мазок".

│ При низкой паразитемии исследование только " тонкого мазка" │

│ может привести к гиподиагностике малярии. │

В " толстой капле" паразиты распределены неравномерно. Поэтому проводят перекрестный просмотр 200 - 300 полей зрения препарата. Целесообразно также обратить внимание на краевую зону, более тонкую часть " толстой капли", где эритроциты могут располагаться в 1 слой и может выявляться не только относительно неизмененная морфология паразита, но и пораженного эритроцита. Если вероятность малярии у пациента велика, а паразиты не выявляются, рекомендуется не увеличивать время просмотра той же самой капли, а просмотреть вторую каплю.

Препарат считается отрицательным, если паразиты не обнаружены после просмотра 200 - 300 полей зрения " толстой капли".

После первого обнаружения паразитов исследование продолжают, чтобы:

- определить видовую принадлежность паразитов;

- не пропустить смешанную инфекцию;

- указать, какие стадии паразитов найдены;

- указать наличие или отсутствие гаметоцитов, что имеет важное прогностическое значение в случае тропической малярии;

- указать количество паразитов, руководствуясь одним из предлагаемых в п. 8 методов.

В " тонком мазке" для обнаружения малярийных паразитов исследуют участок, где эритроциты расположены в один слой - бахромчатую и прилегающую к ней зону, - так называемый хвост препарата. Паразиты имеют тенденцию сосредоточиваться также на краях препарата.

При просмотре " тонкого мазка" используется метод " зубчатая стена": просмотр края мазка последовательными вертикально - горизонтальными передвижениями препарата.

│ Отрицательный диагноз, поставленный только по " тонкому│

│ мазку", считается недостоверным. │

7. КРИТЕРИИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДА ПАРАЗИТА

Определение вида основано на совокупности ряда признаков как самого паразита, так и пораженного эритроцита.

7. 1. Классические морфологические признаки

малярийных паразитов и пораженных эритроцитов

Для установления видовой принадлежности малярийных паразитов имеет значение следующее: наличие полиморфизма возрастных стадий или одной ведущей, их сочетание с гаметоцитами; морфология разных возрастных стадий, их размеры по отношению к пораженному эритроциту; характер, размер ядра и цитоплазмы; интенсивность пигмента, его форма, размеры зерен / гранул; количество мерозоитов в зрелых шизонтах, их размеры и расположение по отношению к скоплению пигмента; склонность паразита к поражению эритроцитов определенного возраста (тропизм); склонность к множественному поражению отдельных эритроцитов несколькими особями паразитов и его интенсивность; размеры пораженных эритроцитов по отношению к непораженным, форма пораженных эритроцитов, наличие азурофильной зернистости в пораженных эритроцитах; форма гаметоцитов.

Основные дифференциально - диагностические признаки возбудителей малярии указаны в Прилож. 1 (табл. 2 - 7) и прилож 2 < *> (рис. 1 - 4).

--------------------------------

< *> Не приводится.

7. 2. Непостоянство некоторых морфологических признаков

В периферической крови у паразитоносителей P. falciparum и при рецидивах этой инфекции, связанных с лекарственной устойчивостью, встречаются более крупные кольца, что обусловлено определенной степенью иммунитета.

У эритроцитов, пораженных P. ovale, может отсутствовать характерная форма. В то же время, при инфекции P. vivax часть эритроцитов может иногда принимать форму, характерную для P. ovale. В некоторых случаях зрелый шизонт P. ovale имеет сходство с соответствующей стадией P. malariae не только по характеру и количеству мерозоитов в зрелом шизонте, но и по их расположению по отношению к скоплению пигмента. Неполный гемолиз эритроцитов, пораженных P. ovale, в " толстой капле", часто описываемый как характерный признак, не является постоянным и встречается также в каплях с P. vivax.

7. 3. Изменения морфологии паразита и пораженных

эритроцитов, возникающие в процессе приготовления

и окраски препаратов крови

При медленном высыхании препарата в условиях повышенной температуры и влажности гаметоциты P. falciparum могут принимать округлую форму и быть ошибочно идентифицированы как гаметоциты других видов плазмодиев, для которых характерна округлая форма. В " тонких мазках" крови, преимущественно у паразитоносителей, могут встречаться крупные кольца P. falciparum, напоминающие лентовидные формы соответствующих стадий P. malariae, что, по-видимому, связано с их изменением в процессе приготовления мазка. Несоблюдение правил приготовления рабочего раствора краски Романовского - Гимза, окрашивания препаратов крови, подготовки предметных стекол может дать ряд отклонений от классической картины (см. табл. 1 Прилож. 1). При приготовлении краски на воде кислой реакции в " тонком мазке" не выявляется зернистость Шюффнера, в " толстой капле" это препятствует полному гемолизу не только пораженных, но и непораженных эритроцитов.

7. 4. Изменения морфологии паразита, связанные

с воздействием химиотерапевтических препаратов

Нередко больные обращаются за медицинской помощью не при первых проявлениях малярии, а после приема химиотерапевтических препаратов, обладающих в разной степени противомалярийным действием. К их числу относятся препараты, обычно применяемые при малярийной инфекции и зачастую используемые больными для самолечения, а также сульфаниламидные препараты, антибиотики тетрациклинового ряда, которые применяют для самолечения, предполагая ОРЗ или тому подобные болезни, либо по назначению врачей в связи с неправильно поставленным диагнозом. Применение химиотерапевтических препаратов приводит к специфическим изменениям морфологии паразита. Эти изменения на начальных этапах воздействия лекарственного препарата могут затруднить идентификацию вида возбудителя, на более поздних этапах ввиду морфологической деградации паразита вовсе препятствовать установлению паразитологического диагноза малярии. Возникающие разнотипные повреждения ядра, цитоплазмы и их тинкториальных свойств, изменения состояния пигмента и т. д. при воздействии разных препаратов выявляются при окраске по Романовскому - Гимза. Они хорошо различимы, в первую очередь у P. vivax, P. ovale и P. malariae.

При воздействии хлорохина (делагила) у бесполых форм начальные различимые изменения возникают спустя 1 - 2 ч после начала лечения, прогрессивно нарастая. В первую очередь меняется характер пигмента: зерна пигмента собираются в отдельные скопления и затем исчезают из цитоплазмы. Ядро на всех возрастных стадиях подвергается пикнозу (уплотнению), наиболее выраженному у кольцевидных (юных) трофозоитов. Цитоплазма кольцевидных трофозоитов уплотняется вокруг ядра и затем постепенно исчезает, начиная с периферии. После исчезновения цитоплазмы у юного трофозоита исчезает его ядро. Цитоплазма у развивающихся и зрелых трофозоитов вакуолизируется, истончается, в ней появляются множественные просветления; так же, как у кольцевидных трофозоитов, цитоплазма постепенно исчезает с периферии паразита. Половые формы, в сравнении с бесполыми формами, сохраняются после воздействия делагила еще 24 - 72 ч (кроме P. falciparum), постепенно деградируя. Женские гаметоциты P. vivax, P. ovale и P. malariae трудно отличить от зрелых трофозоитов этих видов паразита, однако в процессе их деградации после приема делагила клетка женского гаметоцита, в отличие от зрелого трофозоита, в меньшей степени подвергается деформации. Пигмент собирается в крупные гранулы, ядро становится более диффузным и приобретает более светлую окраску. Первоначально из цитоплазмы гаметоцита исчезает пигмент, затем ядро; сохраняется лишь истонченная цитоплазма с множественными просветлениями; затем исчезает и цитоплазма. Обнаружение половых форм, подвергшихся еще неполной морфологической деградации, может привести к неправильному суждению о продолжающемся развитии паразита.

При воздействии сульфаниламидов, тиндурина (пириметамин) и их комбинаций (фансидар, метакельфин), а также тетрациклинов наблюдается противоположный тип изменений морфологии паразита. Возрастает количество видимых зерен пигмента. Ядро становится диффузным, приобретает более светлую окраску, распределяется на отдельные массы хроматина и в последующие сроки исчезает из клетки паразита. Затем исчезает цитоплазма. Пигмент, лежащий на бесцветном фоне, исчезает последним. После воздействия этих препаратов из-за первоначальных изменений состояния ядра, цитоплазмы, характера и интенсивности пигмента P. vivax или P. ovale могут быть ошибочно диагностированы как P. malariae (естественно, если не будет принят во внимание характер пораженного эритроцита и возможность изменения морфологии паразитов в результате предшествовавшего воздействия указанных препаратов).

Приведенные примеры не исчерпывают всех возможных отклонений морфологии плазмодиев от классических признаков. Они лишь свидетельствуют о том, что для правильной идентификации вида возбудителя малярии необходим анализ паразитологической картины в целом, включающий оценку морфологии всех форм развития паразита в эритроцитах, выявляемых в конкретном препарате крови, а также состояние пораженных эритроцитов. При этом следует принять во внимание географический анамнез.

7. 5. Источники диагностических ошибок

Иногда за малярийных паразитов ошибочно могут быть приняты нормальные и патологические элементы крови, а также различные контаминанты.

Наиболее часто симулирует паразита тромбоцит, лежащий на эритроците в " тонком мазке" либо в " толстой капле" на остатке ретикулоцита. Эритробласты или эритроциты с остатками ядра - тельца Жолли или кольца Кэбота также могут быть приняты за пораженные эритроциты.

Клетки бактерий, грибов, а также частицы краски, выпавшие в осадок и лежащие на эритроците, могут приводить неопытного исследователя к ложной диагностике малярии.

Иногда за гаметоциты P. falciparum принимают царапины на стекле - так называемый " хребет селедки", растительные клетки, жгутиковых простейших, которые могут размножиться в старом буферном растворе, особенно в жаркое время года.

Некоторые образования, симулирующие малярийных паразитов, изображены на рис. 5 прилож. 2.

8. ОЦЕНКА ИНТЕНСИВНОСТИ ПАРАЗИТЕМИИ

При оценке интенсивности паразитемии учитывают суммарно бесполые и половые формы, за исключением P. falciparum. Интенсивность паразитемии оценивают одним из следующих методов.

8. 1. Оценка интенсивности паразитемии

по " толстой капле"

8. 1. 1. Определение числа паразитов в 1 мкл крови

Подсчитывается количество паразитов по отношению к определенному количеству лейкоцитов. При обнаружении 10 и более паразитов на 200 лейкоцитов подсчет заканчивается. При обнаружении 9 и менее паразитов на 200 лейкоцитов подсчет продолжают для определения количества паразитов на 500 лейкоцитов. При обнаружении единичных паразитов в " толстой капле" крови подсчитывают их количество на 1000 лейкоцитов.

Определение количества паразитов в 1 мкл крови проводится по следующей формуле:

X = A x ---,

где:

X - количество паразитов в 1 мкл крови;

A - подсчитанное количество паразитов;

B - количество лейкоцитов в 1 мкл крови данного больного;

C - подсчитанное количество лейкоцитов.

В тех случаях, когда нет возможности определить количество лейкоцитов у данного больного, их число в 1 мкл по рекомендации ВОЗ условно принимают равным 8000.

8. 1. 2. Ориентировочная оценка паразитемии " по крестам"

Этот метод не дает полного представления относительно интенсивности паразитемии и используется только в случае, когда нет возможности определить количество паразитов в 1 мкл крови.

+	1 - 10 паразитов на 100 полей зрения
++	11 - 100 паразитов на 100 полей зрения
+++	1 - 10 паразитов на 1 поле зрения
++++	более 10 паразитов на 1 поле зрения

8. 1. 3. Оценка паразитемии по среднему количеству паразитов по отношению к полям зрения микроскопа

Результат оценивается при просмотре не менее 200 - 300 полей зрения. Например, 20 - 30 паразитов в одном поле зрения или 2 - 3 паразита на 10 полей зрения и т. п.

8. 2. Оценка интенсивности паразитемии по " тонкому мазку"

в процентах пораженных эритроцитов

Подсчитывается количество пораженных эритроцитов, приходящееся на 10000 эритроцитов. Этот метод позволяет получить представление об интенсивности паразитемии при ее относительно высоком уровне до начала лечения и на протяжении последующего периода после начала лечения, когда еще имеется возможность обнаружения паразитов по отношению к 10 тыс. эритроцитов.

Определение процента пораженных эритроцитов проводится по следующей формуле:

100

X = N x -----,

10000

где:

X - процент пораженных эритроцитов;

N - число пораженных эритроцитов на 10000 подсчитанных эритроцитов.

9. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОФОРМЛЕНИЕ ОТВЕТА

Результаты исследований на малярию регистрируются в отдельном журнале, где обязательно должны быть предусмотрены графы: паспортные данные обследуемого, домашний адрес, дата забора крови и приготовления кровепрепаратов, дата лабораторного исследования, ход исследования, результат исследования. Если паразиты не найдены, следует указать: " Малярийные паразиты не обнаружены". При положительном ответе - указать родовое латинское название Plasmodium (допускается сокращение до буквы " P. " ), видовое пишется полностью: " vivax", " falciparum", " ovale", " malariae". Необходимо указывать также интенсивность паразитемии (см. п. п. 8. 1, 8. 2), возрастные стадии, наличие или отсутствие половых форм, что имеет особое значение при P. falciparum.

Порядок поступления препаратов на подтверждение лабораторного диагноза из лечебно - профилактических учреждений: все положительные кровепрепараты с направлением поступают в территориальный центр госсанэпиднадзора. Для окончательного подтверждения лабораторного диагноза микропрепараты из территориального центра госсанэпиднадзора поступают в областные, краевые и республиканские центры госсанэпиднадзора.

ОБРАЗЕЦ ЖУРНАЛА

(ДЛЯ КЛИНИКО - ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЙ ЛПУ)

Дата		N п/п	Ф. И. О. обсле- дуемо- го	Воз- раст	До- маш- ний ад рес	Количество приго- товленных препара- тов крови			Результат исследо- вания (с указанием возраст- ных ста- дий, на- личия по- ловых форм, уровня паразите- мии при положи- тельном результа- те)	Под- пись вра- ча
за- бора кро- ви	ис- сле- до- ва- ния					Количество приго- товленных препара- тов крови
за- бора кро- ви	ис- сле- до- ва- ния					" тол- стых ка- пель" (ок- ра- шен- ных, неок- ра- шен- ных)	" тонких мазков" (фикси- рован- ных, окра- шенных, неокра- шенных)	из них от- прав- лено на конт- роль в ЦГСЭН
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11

ОБРАЗЕЦ ЖУРНАЛА

(ДЛЯ ЦЕНТРОВ ГСЭН)

Дата по- сту- пле- ния пре- па- ра- тов кро- ви	N п/п	Ф. И. О. обсле- дуемо- го	Воз- раст	До- маш- ний ад- рес	Сведе- ния о пребы- вании в эн- демич- ной мест- ности	Количество посту- пивших препаратов крови из ЛПУ и ре- зультаты их иссле- дования в ЛПУ		Результат исследо- вания (с указанием возраст- ных ста- дий, на- личия по- ловых форм, уровня паразите- мии при положи- тельном результа- те)	Подпись врача и дата выдачи резуль- татов
Дата по- сту- пле- ния пре- па- ра- тов кро- ви	N п/п	Ф. И. О. обсле- дуемо- го	Воз- раст	До- маш- ний ад- рес		" толстых капель" (окрашен- ных, не- окрашен- ных)	" тонких мазков" (фиксиро- ванных, окрашен- ных, не- окрашен- ных)		Подпись врача и дата выдачи резуль- татов
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

⇐ Предыдущая 123 4 Следующая ⇒