КАК ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОРТИКАЛЬНЫХ МТ С КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКОЙ РАСТЕНИЙ?

СТРУКТУРА КОРТИКАЛЬНОЙ СЕТИ. Кортикальные пучки МТ располагаются под плазмалеммой, и представляют собой перекрывающиеся МТ разной длины. Ориентация и расположение пучков зависит от стадии роста и дифференцировки клеток.

1) Так, в активно делящихся клетках, МТ не имеют упорядоченной ориентации. Хаотическая ориентация кортикальных МТ рассматривается как первичная организация, из которой затем формируются последующие более упорядоченные системы.

2) По мере роста, удлинения и дифференцировки клеток, ориентация МТ упорядочивается и пучки ориентируются перпендикулярно длинной оси клетки (но не всегда – это зависит от направления деления и характера роста). СЛАЙД – (а) В быстро удлиняющихся клетках кортикальные МТ ориентированы перпендикулярно оси роста клеток. Полярность МТ в пучках неоднородна – МТ могут быть ориентированы одно направленно или разно направленно по отношении друг к другу.

3) Однако при замедлении роста (тот же СЛАЙД) (b) пучки меняют ориентацию относительно длинной оси клетки, и часто укладываются параллельно длинной оси клетки.

В клетках из разных органов растений кортикальные МТ будут иметь разное расположение и ориентацию относительно направления роста клеток (СЛАЙД из Fishel and Dixit, 2013).

Были проделаны исследования, которые показали, что новые МТ могут отрастать от поверхности уже существующих МТ. Кроме этого, динамика этих МТ имеет ряд особенностей. Исследование динамики полимеризации МТ в кортексе показало, что МТ находятся в состоянии гибридного тредмиллинга (плюс конец показывает динамическую нестабильность, и минус конец – паузы или деполимеризацию) - СЛАЙД.

(A) Две новые МТ (стрелки) полимеризуются от сайта в кортексе (стрелка) и расходятся от этой точки в разные стороны. (B) Новые МТ (сплошные стрелки) отсоединяются от кортикальных сайтов нуклеации. После отсоединения вторая МТ (стрелка) инициируется в том же месте. (C) Движущаяся МТ (стрелка) пересекает одну МТ перед тем как столкнется со второй МТ и образуется пучок (стрелки). В ходе такого гибридного тредмиллинга, МТ мигрируют в кортексе без участия моторных белков.

ПРОИСХОЖДЕНИЕ КОРТИКАЛЬНЫХ МТ. Перед митозом кортикальные МТ разбираются (так же, как и интерфазные МТ в клетках животных), и появляются снова уже в G1 фазе. Поэтому закономерно встал вопрос о том, как они появляются. Существует несколько вариантов развития событий:

-МТ инициируется в кортикальной цитоплазме;

-Ядерная поверхность инициирует рост МТ, которые отделяются от нее и перемещаются в кортикальную цитоплазму. Там они реорганизуются и формируют кортикальную сеть.

Как известно, маркером нуклеации МТ является γ-тубулин. В клетках растений γ-тубулинприсутствуетв цитозоле, в связи с поверхностью МТ, также есть ядерная фракция g-тубулина (выявляется в ядре и в области кинетохоров). Какова роль g-тубулина в нуклеации МТ у высших растений?

СЛАЙД из работы Murata et al., 2005. Было показано, что кортикальные МТ нуклеируются при участии γ-тубулина рекрутированного из цитозоля на поверхность уже существующих МТ. Предполагают, что γ-тубулин мигрирует между цитозолем и МТ, и активен только в связи с МТ. Он освобождается в цитозоль после деполимеризации МТ. В геноме Arabidopsis найдены все белки, которые формируют γ-TuSC и γ-TuRC. Сайты нуклеации МТ были обнаружены как в связи с уже существующими в кортексе МТ, так и в зонах, где до этого МТ не было.

Нуклеация в кортексе происходит при участии свободных γ-TuRC, но большая их часть связана со стенками уже существующих МТ. Данные Murata et al указывают на то, что для нуклеации МТ, свободные γ-TuRC рекрутируются на поверхность уже существующих МТ. Новая МТ отрастает от старой под углом в 40^о, что выглядит как формирование ветвящихся пучков. Цитоплазматические γ-TuRC перемещаются между цитоплазмой и поверхностью кортикальных МТ, и нуклеирующая активность проявляется только тогда, когда они ассоциированы со стенкой МТ.

СЛАЙД – МОДЕЛЬ НУКЛЕАЦИИ МТ В КОРТЕКСЕ. Интерфазные МТ нуклеируются и заякориваются в клеточном кортексе. (а) Небольшое количество затравок МТ появляются в кортексе в ранней интерфазе. Новые кортикальные МТ формируются из существующих МТ в виде ответвлений, отходящих под определенным углом. Новые МТ открепляются от сайтов нуклеации и мигрируют в кортекс. Нуклеирующий комплекс (NC) остается в том же месте в кортексе после деполимеризации старой МТ, и в течение определенного времени остается функциональным. Стрелки указывают на направление плюс концов МТ. (b) После того как минус конец МТ отсоединяется от сайта нуклеации, МТ ассоциирует с внутренней поверхностью плазматической мембраны (РМ), возможно, всей поверхностью или только у плюс конца МТ, при участии определенных плюс конец кэппирующих белков. Случайная утрата контакта с кортексом, возможно у плюс конца, может вызвать как быструю разборку плюс конца так и его ре-ассоциацию с кортексом.

Участвует ли в этих процессах ЯДРО? Во время митоза в клеточном кортексе практически нет МТ. Поэтому МТ затравки там должны появится de novo. Отходящие от ядра радиальные МТ на стадии ранней интерфазы могут распределять такие затравки от ядра в кортекс. Возможно, что после завершения митоза МТ временно нуклеируются на поверхности ядра и растут в клеточный кортекс. В это же время γ-тубулин сначала аккумулируется у поверхности ядра, а затем перераспределяется в кортекс, что указывает на то, что радиальные МТ могут участвовать в распределении комплексов γ-TuRC от ядра к периферии цитоплазмы. Однако последние исследования показали, что практически на протяжении всей интерфазы большинство новых МТ инициированы de novo у клеточного кортекса и они не являются производными от радиальных МТ.

Варианты нуклеации МТ в клетках растений показаны на СЛАЙДЕ из обзора Hashimoto (2013). (а) МТ нуклеируются от ЯО; (b) в веретене и фрагмопласте аугмин рекрутирует на поверхность МТ γ-TuRC и генерирует нуклеацию новых МТ под острым углом; (с) и (d) в кортексе МТ могут нуклеироваться параллельно материнским МТ (с) или в виде ветвящихся структур под углом около 40 градусов. Параллельные или ветвящиеся модели нуклеации обеспечиваются определенными факторами прикрепления (пока не идентифицированы) и ПТМ, такими как фосфорилирование (показано как Р). Предполагается, что γ-TuRC прикрепляются к МТ в разной геометрической ориентации, в результате чего нуклеируются ветвящиеся или параллельные МТ. По-видимому, геометрия прикрепления зависит от природы рекрутирующих факторов, ПТМ у γ-TuRC. Так, например, у одних типов клеток преобладает ветвящийся вариант нуклеации, а у других – параллельный. Среди регуляторов и адаптерных белков для γ-TuRC у растений известны – агумин (для МТ веретена и фрагмопласта), NEDD1, GIP1 (растительный ортолог белка MOZART1 у млекопитающих).

СЛАЙД – МОДЕЛЬ АКТИВАЦИИ НУКЛЕИРУЮЩИХ КОМПЛЕКСОВ. Не активированные γ-TuRC присутствуют в цитоплазме. Когда они рекрутируются на уже существующие кортикальные МТ, происходит активация нуклеирующей способности. Активированные γ-TuRC связываются с аугмином (голубые квадраты) и возможно, другими регуляторными факторами. Дочерняя МТ отрастает от материнской под углом примерно 40^о или параллельно (сейчас рассматривается еще одна модель – МТ могут нуклеироваться не только под углом в 40 градусов, но и параллельно материнской МТ; такой способ нуклеации ведет к мгновенному формированию пучков МТ). Если катанин отрезает минус конец дочерней МТ (фиолетовая стрелка) или динамичный плюс конец дочерней МТ полностью деполимеризауется, нуклеирующий комплекс дестабилизируется и отделяется от материнской МТ. Освобожденный γ-TuRC может затем вступить в новый цикл активации.

ОРГАНИЗАЦИЯ КОРТИКАЛЬНЫХ ПУЧКОВ. Исходя из механизмов нуклеации, МТ полимеризуются в кортексе не в виде упорядоченно ориентированных пучков, а достаточно хаотически. После нуклеации МТ, они обычно отсоединяются от сайтов нуклеации, но остаются заякоренными в кортексе. ЭМ исследования показали, что между МТ и плазмалеммой есть тесная связь. Одно время, основным кандидатом на роль линкера между МТ и плазмалеммой является ассоциированная с плазмалеммой фосфолипаза Д (phospholipase D). Однако, есть и другие «кандидаты» на линкерную функцию между МТ и плазмалеммой: 1) белок CLASP, 2) связанный с мембраной формин (который также обеспечивает связь с мембраной актиновых филаментов), 3) МТ связывающие белки, которые ассоциированы с целлюлоза-синтазными комплексами, 4) МАР-65.

Каким образом достигается упорядоченная организация МТ? Могут быть разные объяснения: 1) МТ разной ориентации и расположения селективно стабилизируются. 2) После нуклеации, многие МТ открепляются от сайтов нуклеации и перемещаются по кортексу в ходе гибридного тредмиллинга. Общий результат – перемещение или транслокация МТ без участия моторных белков, просто за счет полимеризации-деполимеризации.

СЛАЙД -ПОСЛЕДСТВИЯ РАЗНЫХ ВАРИАНТОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ СВОБОДНЫХ МТ В КОРТИКАЛЬНОЙ ЦИТОПЛАЗМЕ, из обзора Hashimoto, 2016. Во время гибридного тредмиллинга, МТ могут сталкиваться друг с другом под разными углами. Однако, столкновение под тупым (steep) углом способствует деплимеризации МТ, в то время как столкновение под острым (shallow) углом способствует формирование пучков Это простое правило взаимодействия МТ является важным в само-организации МТ в параллельно уложенные пучки. Последствия такого взаимодействия: если угол меньше 30^о, то происходит преимущественное укладывание МТ в пучки, а если больше 40^о – то процесс образования пучков менее эффективен. Как только МТ попала в пучок, она остается в его составе на продолжительное время, то есть, пучки являются позиционными и ориентационными «ловушками» для МТ. Оба процесса – миграция полимера и зависимое от угла взаимодействие МТ, которое ведет к формированию пучков, обеспечивают само-организацию полимера, и таким образом увеличивают упорядоченность систем на каждом локальном уровне. Безусловно, в формировании пучков МТ у растений ключевую роль играют МАР.

ФУНКЦИИ КОРТИКАЛЬНОЙ СЕТИ

Активно делящиеся растительные клетки, перед тем как они трансформируются в различные специализированные клеточные субпопуляции, активно растут. Эти клетки имеют клеточную стенку, состоящую из целлюлозы, гемицеллюлозы и других компонентов матрикса, поэтому упорядоченное формирование клеточной стенки и ее последующее разрыхление является необходимым для процесса направленного роста. Микрофибриллы целлюлозы, которые откладываются перпендикулярно оси роста клетки, играют важную роль в морфогенезе клеток. Поперечная ориентация микрофибрилл целлюлозы позволяет им направленно разрыхляться или разрежаться. В этом процессе активную роль играют ферменты экспансины.

Поперечная ориентация микрофибрилл целлюлозы контролируется кортикальными МТ, которые располагаются непосредственно под плазматической мембраной (гипотеза параллелизма МТ и микрофибрилл целлюлозы) - СЛАЙД. Эта гипотеза поддерживается двумя группами фактов. Во-первых, кортикальные МТ почти всегда расположены параллельно фибриллам целлюлозы. Во вторых, изменение ориентации МТ с помощью ингибиторов полимеризации вызывает изменения в ориентации фибрилл целлюлозы и ведет к неполяризованному росту клеток. Мультибелковый ферментный комплекс – целлюлоза-синтетаза, которая инкорпорирована в плазмалемму, может двигаться вдоль кортикальных МТ и использовать их как векторы для параллельного откладывания только что синтезированных микрофибрилл целлюлозы в клеточной стенке.

Дальнейшие исследования с использованием разных ингибиторов и мутантных клеток подтвердили гипотезу о направляющей роли МТ, но иногда ориентация МТ и микрофибрилл может быть не связанной, и микрофибриллы лежат параллельно друг другу в отсутствие интактных кортикальных пучков. Эти наблюдения указывают на то, что функции МТ в организации клеточной стенки, скорее всего, более сложные, чем простое соответствие (one-on-one guidance).

СЛАЙД-ОРГАНИЗАЦИЯ КОРТИКАЛЬНЫХ МИКРОТРУБОЧЕК (ЗЕЛЕНЫЕ) ОТРАЖАЕТ РАСПОЛОЖЕНИЕ МИКРОФИБРИЛЛ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ (РОЗОВЫЕ). Переход от хаотической организации к упорядоченной направляет поляризованный рост клеток.

КАК ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОРТИКАЛЬНЫХ МТ С КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКОЙ РАСТЕНИЙ?

Основной является гипотеза параллелизма МТ и микрофибрилл целлюлозы (МФЦ). По этой теории, МТ, тесно связанные с плазмалеммой, образуют барьеры (дорожки) которые отграничивают («стесняют») направление перемещения комплексов целлюлоза-синтетазы, вставленных в плазматическую мембрану, во время отложения цепочек целлюлозы в клеточной стенке.

Однако есть данные, которые указывают, что хорошо организованные МФЦ могут формироваться в отсутствие МТ. Поэтому была предложена матричная гипотеза (templated incorporation model), согласно которой МФЦ прикрепляются к скэффолду, отложенному при участии МТ. Поэтому МФЦ могут откладываться по направлению заданному скэффолдом независимо от отсутствия или присутствия кортикальных МТ.

Целлюлозане секретируется клеткой, а синтезируется при участии крупных трансмембранных белковых комплексов, встроенных в плазматическую мембрану. Этот комплекс (целлюлоза-синтетаза – CSC – Cellulose Synthase Complex) представляет собой гексагональную розетку 25 нм в диаметре. Каждая розетка состоит примерно из 36 каталитических субъединиц белка CESA (белок существует в виде не менее трех изоформ). Продукт слияния CESA6 с YFP позволил пронаблюдать взаимоотношения МТ с комплексом целлюлоза-синтетазы в живых клетках (СЛАЙДиз Paredez et al., 2006). Комплекс CESA6-YFP локализовался в плазматической мембране в виде линейно уложенных частиц. Эти частицы перемещались вдоль линейных траекторий с постоянной скоростью, причем их траектория совпадала с траекториями расположения МТ. Более того, если МТ деполимеризовались, паттерн CESA6-YFP координированно изменялся, при этом полимеризация МТ всегда предшествовала новой организации и новым траекториям частиц. Колокализация CESA6-YFP с МТ наблюдалась часто (в 60% случаев), но не всегда. Это неудивительно, если принимать во внимание большие различия в динамических свойствах обеих систем. Динамическое состояние МТ меняется намного быстрее, оставляя CESA6-YFP комплексы свободными. При этом, сами комплексы не утрачивают способности к перемещению даже после того, как потеряли связь со своими МТ.

СПОСОБЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИКРОТРУБОЧЕК И ЦЕЛЛЮЛОЗА-СИНТЕТАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВдо конца не выяснены (СЛАЙД из обзора Lei et al., 2014). Предполагают, что между ними может быть прямая связь, или же МТ формируют некие матрицы, по которым двигаются CSC. В пользу первого предположения свидетельствует выявление белка, который осуществляет непосредственную связь между МТ и CSC - Cellulose synthase interactive protein 1 (CSI1). Кроме этого, данный белок играет важную роль в поддержании поддерживании нормальной динамики CSC. У CSI1 есть С-терминальный домен, который обладает липид-связывающей активностью. Это дает возможность CSI1 оказывает влияние на организацию специализированных липидных микро-доменов, в которые вставлены комплексы CSC. Если CSC располагаются в островках с определенным липидным составом, некоторые свойства таких островков (текучесть мембраны) могут отличаться от свойств остальной плазматической мембраны. Кортикальные МТ, возможно, направляют формирование микро-доменов плазматической мембраны, а домены, в свою очередь, могут оказывать влияние на активность CSC. Вероятно, между кортикальными МТ, специализированными липидными микро-доменами, CSI1 и CSC существуют определенные взаимоотношения, которые обеспечивают механизм для МТ-зависимой организации липидных островков, содержащих CSC. Полноценное функционирование (синтез целлюлозы) поддерживается только в связи с целостностью всех компонентов.

Несмотря на то, что синтез целлюлозы идет у плазматической мембраны, считается, что сборка CSC происходит в аппарате Гольджи, и затем комплексы экзоцитируются через мембрану. Везикулы от аппарата Гольджи, которые принимают участие в экзоцитозе комплексов, называются small CESA compartments (smaCCs) или microtubule-associated cellulose synthase compartments (MASCs). Установлено, что комплексы преимущественно доставляются к сайтам на плазматической мембране, которые совпадают с расположением кортикальных МТ. Доставленные комплексы в течение нескольких секунд иммобилизованы, а затем начинают двигаться с постоянной скоростью по нижележащим МТ.

СЛАЙД - An overview of the localization, trafficking pathways and proposed trafficking mechanisms of CSCs.

Пектин и гимецеллюлоза синтезируются в аппарате Гольджи, а затем эти полимеры секретируются из клетки, после чего они входят в состав клеточной стенки. Однако, целлюлоза синтезируется с помощью CSC комплексов, котрые располагаются в плазматической мембране. Комплексы собираются в аппарате Гольджи (который, в свою очередь, зависит от актинового цитоскелета) и секретируются через TGN компартмент (они могут селективно накапливаться в определенных доменах TGN). Механизмы траффика CSC от TGN не очень хорошо изучены, но в нем могут участвовать везикулы, покрытые клатрином. Механизм слияния CSC несущих везикул с плазматической мембраной также плохо изучен, но известно, что это происходит в связи с кортикальными МТ. Предполагается, что в слиянии может принимать участие комплекс exocyst. Локализованные в плазматической мембране CSC двигаются в двух направлениях (bi-directionally) по кортикальным МТ, и считают, что это движение обеспечивает сила полимеризации целлюлозы. Связь CSC с микротрубочками осуществляют белки CSI. Эндоцитоз CSC комплексов происходит через AP2/clathrin-mediated endocytosis, и после этого эндоцитированный материал быстро доставляется в TGN, где происходит рециклирование CSC. MASC - Microtubule-Associated Cellulose Synthase compartments – это везикулы, которые содержат CSC и прикреплены к МТ. Комплексы CSC и CSI-containing cortical MASCs могут участвовать в секреции, эндоцитозе и рециклировании. В движении MASC могут участвовать кинезины.

ТАКИМ ОБРАЗОМ, ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИИ ИНТЕРФАЗНЫХ МТ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ состоят в следующем:

Кортикальные пучки отвечают за регулярное отложение МЦФ, что обеспечивает правильный морфогенез (деление, рост и дифференцировку) клеток растений.

Радиальная системаобеспечивает связь ядра с кортексом, заякоривание ядра в центре клеток (вакуолизированные клетки), возможный источник МТ (в случае нуклеации МТ от ядра) для построения веретена и фрагмопласта (между несестринскими ядрами при целлюляризации эндосперма, микроспорогенезе).

⇐ Предыдущая 1 2 3 45