Глюкозо-1-фосфат ↔ Глюкозо:б-фосфат

Глюкозо-1-фосфат ↔ Глюкозо:б-фосфат

Фосфоглюкомутаза

Принцип метода.

Мерой активности фермента служит убыль глюкозо-1-фосфата в испытуемой пробе. Поскольку в процессе ферментативного катализа происходит превращение легкогидролизуемого соединения (глюкозо-1-фосфат) в трудно-гидролизуемое (глюкозо-6-фосфат), можно высчитать убыль глюкозо-1-фосфат по разнице содержания неорганического фосфата в опытной и контрольной пробах. Определение проводят после кипячения проб в 1н серной кислоте в течение 10 минут.

Проведение ферментативной реакции.

Схема заполнения проб:

№ пробы 1 (контроль)

Субстрат (0,01M гл-1-ф =5мкМ) 0,5 мл 0,5 мл 0,5 мл

ТХУ 1,0 мл — —

Пробы перемешивают.

Фермент 0,5 мл 0,5 мл 0,5 мл

Пробы перемешивают и оставляют на 30 минут при комнатной температуре

ТХУ ____ 1,0 мл 1,0 мл

Пробы фильтруют через бумажный фильтр. Затем к фильтрату добавляют по 2 мл 2н Н₂S0₄ и пробы кипятят в водяной бане в течение 10 минут. После охлаждения проб определяют содержание в них неорганического фосфата

Определение неорганического фосфата по методу Фиске-Суббароу.

Неорганический фосфат при взаимодействии с молибденовокислым аммонием образует фосфорномолибденовокислый аммоний, который в присутствии восстановителя превращается в смесь окислов молибдена, окрашенных в синий цвет.

Рабочие растворы: 2,5% раствор молибдата аммония на 1н Н₂S0₄, 0,08% раствор эйконогена, содержащий NаНSОз и Nа2SОз.

Схема заполнения проб:

№ пробы 4 (фотометричес кий контроль)

Раствор с неорганическим фосфатом (фильтрат) 4,0 мл 4,0 мл 4,0 —

Молибдат аммония 0,8 мл 0,8 мл 0,8 мл —

Эйконоген 0,2 мл 0,2 мл 0,2 мл —

Вода — — — 5,0 мл

Пробы перемешивают и оставляют на 30 минут при комнатной температуре.Затем фотометрируют при 660 нм. По разности в количестве фосфата в опытной и контрольной пробах рассчитывают количество глюкозо-1-фосфат, превращенного в глюкозо-6-фосфат.

⇐ Предыдущая 12