Снижают давление.

Ферменты микробов, их использование для идентификации. Ферменты – специфические белковые катализаторы, способствующие протеканию той или иной реакции (за счёт снижения энергии активации). Микроорганизмы синтезируют ферменты всех шести классов. Синтез ферментов определяется определёнными генами и является стабильным признаком микроорганизма, что позволяет использовать определение ферментативной активности микробов в диагностике. Ферменты могут локализоваться в цитоплазме, периплазматическом пространстве, на мембране и даже выделяться в окружающую среду. По отношению к окружающей среде различают: 1. Эндоферменты. Эндоферменты часто объединены структурно и функционируют в составе единого мультиферментного комплекса (например, ЦПЭ). 2. Экзоферменты (их функция – расщепление веществ для транспорта их в клетку). Экзоферменты патогенных микроорганизмов являются важными факторами вирулентности. По зависимости синтеза ферментов от наличия субстрата различают: 1. Конститутивные (синтезируются постоянно, например, ферменты гликолиза). 2. Индуцибельные (синтезируются при наличии соответствующего субстрата, например, ферменты транспорта лактозы). 3. Репрессибельные (ферменты, синтез которых подавляется при накоплении избыточного количества продукта реакции, катализируемой данным ферментом). Методы определения протеолитической и сахаролитической способности микробов: питательные среды, продукты расщепления и их определение. Сахаролитические ферменты микробов. Под действием сахаролитических ферментов сахара (углеводы, спирты) расщепляются на альдегиды и кислоты, конечными продуктами их разложения являются углекислый газ и вода. Для определения сахаролитических способностей исследуемую культуру засевают в питательные среды Гисса, называемые «пёстрым» рядом. «Пёстрый» ряд Гисса содержит обычно 5 пробирок: с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. Среды Гисса бывают жидкими и полужидкими. Ферментация сахара с образованием кислоты определяется по изменению цвета среды. Для определения газообразования в жидкие среды опускают поплавок (трубочку, запаянную с одного конца). В процессе стерилизации поплавок заполняется питательной средой. Если ферментация сахара сопровождается образованием газа, то он вытесняет из поплавка питательную среду и поплавок всплывает. В место поплавка может быть использована поролоновая губка. Протеолитические ферменты микробов. Многие микроорганизмы синтезируют протеазы, под действием которых белок распадается на пептоны, полипептиды или аминокислоты. Различают несколько способов определения протеолитических свойств микроорганизмов. 1. На желатине. Культуру высевают уколом в пробирки с мясопептонным желатином. Пробирки инкубируют в термостате при температуре 37⁰ С в течение 20 дней с ежедневным просмотром. Если под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатина, наблюдается разжижение среды. 2. На молочном агаре Эйкмана. Культуру засевают отдельными колониями в чашки Петри с молочным агаром. Вокруг культур, продуцирующих протеолитический фермент, обуславливающий пептонизацию молока, образуются прозрачные зоны. 3. В бульоне с яичным белком или в бульоне Хоттингера (с кусочками печени КРС). В бульон засевают культуру и инкубируют в течение 6 дней с ежедневным просмотром. В случае наличия у микроорганизмов протеолитических ферментов, кусочки яичного белка или печени уменьшаются в размерах. Некоторые микроорганизмы расщепляют белок до индола, сероводорода, мочевины, аммиака. 4. Определение индола. Тотчас после посева культуры в пробирку с питательной средой, содержащей белки, в неё опускают полоску индикаторной бумаги (индикаторная бумага не должна касаться питательной среды). Культуру инкубируют при температуре 37⁰ С в течение 1-2 дней. Образование индола определяют по окрашиванию индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет. 5. Определение сероводорода. Тотчас после посева культуры в пробирку с мясопептонным бульоном в неё опускают полоску индикаторной бумаги, пропитанной ацетатом свинца (индикаторная бумага не должна касаться питательной среды). Культуру инкубируют при температуре 37⁰ С в течение 1-2 дней. Образование сероводорода определяют по окрашиванию индикаторной бумаги в чёрный цвет. Для экспресс - методов определения ферментативной активности микроорганизмов применяют микротестсистемы и СИБ. Микротестсистемы представляют собой контейнер из полистирола, состоящий из нескольких ячеек. Ячейки содержат высушенные питательные среды с углеводами и индикаторами рН. В каждую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определённой густоты, в контрольные ячейки наливают физраствор. Результат учитывают после 3-4 часовой инкубации в термостате по изменению цвета индикатора. СИБ используют для идентификации семейства энтеробактерий. СИБ представляют собой диски или полоски хроматографической бумаги, покрытые защитной плёнкой из поливинилового спирта и содержащие определённый субстрат и индикатор. В пробирки с буферным или физраствором вносят полную петлю культуры или каплю густой микробной взвеси. Обожженным пинцетом помещают в пробирку диски. В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят. Результат учитывают по изменению цвета индикатора. Для определения сероводорода диск помещают на поверхность пробирки с МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определять подвижность. Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный – через 18-24 часа. Оксидазная активность определяется путём растирания культуры на индикаторной бумажке через 30-60 секунд. Выделение чистых культур аэробов и анаэробов. Чистой культурой микробов называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из одной микробной колонии. Под микробной колонией понимают потомство одной микробной клетки. Выделение чистой культуры микробов является обязательным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура микробов необходима для изучения морфологических, культуральных, антигенных, тинкториальных и других свойств микроорганизмов, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма. Методы выделения чистых культур. 1. Использование элективных питательных сред (стимулируют развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается вывести). 2. Использование устойчивости микробов данного вида к действию определенного фактора, вызывающего гибель микробов других видов (например, микобактерии туберкулёза безразличны к действию концентрированных растворов минеральных кислот в отличие от других бактерий, содержащихся в мокроте). 3. Заражение лабораторных животных, восприимчивых к тому виду микробов, который необходимо выделить. Выращивание и выделение чистых культур анаэробов. По характеру дыхания все микробы делятся на аэробы и анаэробы. Аэробы для своего существования нуждаются в кислороде, процесс дыхания протекает у них по типу окислительной реакции. Анаэробы растут и размножаются в условиях, исключающих доступ кислорода воздуха, молекулярный кислород оказывает на них токсическое действие. Необходимую для существования энергию анаэробы получают путём расщепления органических и неорганических соединений, входящих в состав питательной среды. Между крайними группами облигатных аэробов и анаэробов есть микроорганизмы, способные менять анаэробный на аэробный тип дыхания в зависимости от среды обитания. Такие микроорганизмы называются факультативными анаэробами. Для выращивания анаэробов необходимо создать условия, сущность которого заключается в удалении молекулярного кислорода. Другим важным условием является занесение большого количества посевного материала в питательную среду. Основные методы выращивания анаэробов. 1. Использование термостата-аэростата, содержащего специальную газовую смесь: 3-5% О₂, 10% СО₂, 85% N₂. 2. Использование анаэростата – герметичного цилиндра, заполненного газовой смесью и соединённого с манометром. 3. Использование герметичных сосудов. 4. Накрывание сред полными целлофановыми пакетами (несколько штук), внутрь пакета кладётся камппакет, содержащий реактивы, взаимодействующие при добавлении воды с образованием СО₂ и поглощением О₂ (например, бикарбонат натрия и лимонная кислота). 5. Глубинный метод посева Филдсома. 6. Глубинное засевание материала, сверху – голодный агар. 7. Выращивание анаэробов под стеклом. 8. Заливание пробирок с жидкими питательными средами вазелиновым маслом. Несвежие питательные среды (2-3 суток) надо подвергать регенерации прогреванием на водной бане в течение 20 минут для удаления воздуха. Регенерированные среды быстро охлаждают под краном до температуры 45⁰ С. Кроме того, для сорбции кислорода могут быть использованы глюкоза, аскорбиновая кислота, цистеин, кусочки ваты, пемзы. Основные среды для посева анаэробов. 1. Среда Китта-Тароцци (кусочки печени КРС + МПБ +1% глюкоза + вазелиновое масло) используется для выделения чистой культуры, определения протеолитических свойств. При росте анаэробов среда мутнеет с образованием газа и запаха. 2. Тиогликолевая среда используется для контроля стерильности крови, шовного материала, смывов с медицинского инструментария. 3. Среда Вильсон-Блера – железосульфитный агар, при росте анаэробов среда чернеет с образованием пузырьков газа. 4. Полужидкий агар на бульоне Мартена + 0,3% глюкозы + 0,1% агар-агара. 5. Полужидкие среды Гисса для определения ферментации углеводов. 6. Кровяной агар Цейсслера (3% МПА + 1-2% глюкоза + 15-20% крови) – определение гемолитических свойств. 7. Сахарный агар. 8. Стерильное обезжиренное молоко. 9. Полужидкий агар высоким столбиком – тест на подвижность.

Влияние внешней среды на микроорганизмы. Влияние физических и химических факторов. К физическим факторам, оказывающим влияние на микроорганизмы, относят механические, термические, лучистые. Термические и лучистые факторы – это высокие и низкие температуры, УЗ, УВЧ, СВЧ, радиоволны, высушивание. В качестве термических факторов можно привести горячий воздух, горячая вода (при температуре 80⁰ С погибают большинство вегетативных форм бактерий), низкие температуры (жизнеспособность бактерий резко снижается), высушивание. Химические вещества, убивающие бактерий, называют бактерицидными, а угнетающие их жизнедеятельность – бактериостатическими. Вещества, убивающие споры, называют спороцидными, убивающие вирусы – вирулицидными, убивающие грибы – фунгицидными. Механизм действия химических веществ складывается из проникновения средства в клетку и реакции между действующим веществом и составными частями клетки. По механизму действия химические вещества разделяют на окислители (окисляют белки клетки), кислоты и щёлочи (вызывают гидролиз белков с помощью водородных и гидроксильных ионов, омыление жиров, расщепление углеводов, набухание клеток), спирты (вызывают коагуляцию белков), галогены (галогенизируют белки). Понятие о стерилизации, дезинфекции, асептике, антисептике. Стерилизация – уничтожение всех микроорганизмов в их различных формах, включая споровые, с помощью физических и химических средств. Стерилизация является основой асептики – системы профилактических мероприятий, направленных против попадания микроорганизмов в раны больного при хирургических вмешательствах, перевязках, различных лечебных манипуляциях. Под антисептикой понимают применение различных препаратов, в основном химической природы (антисептических средств) для обеззараживания рук оперирующего персонала и кожи операционного поля, а также непосредственно раневых поверхностей. Основное требование к антисептическим средствам – широкий спектр антибактериального действия при меньшем побочном действии. Дезинфекция – уничтожение в окружающей человека среде патогенных микроорганизмов, а также их токсинов. Целью дезинфекции является уничтожение возбудителя инфекции в обсемененных объектах. Дезинфекция преследует задача уничтожения патогенных (а не всех) микроорганизмов, этим дезинфекция отличается от стерилизации. Дезинфекционные мероприятия специфичны и направлены на уничтожение возбудителя определённой болезни (учитывается механизм передачи, степень обсеменённости объекта). Методы стерилизации и их характеристика: аппараты, действующее начало, режим. Большое значение стерилизация имеет в профилактике внутрибольничных инфекций. Источниками внутрибольничных инфекций являются больные с острыми и хроническими гнойно-септическими заболеваниями, а также бессимптомные носители патогенных микроорганизмов среди больных и медицинского персонала. Стерилизация играет решающую роль в предупреждении распространения заболеваний, возбудители которых передаются через кровь. Стерилизацию проводят паровым, воздушным, химическим (растворами и газами) методами, а также с помощью ионизирующего излучения. Выбор метода стерилизации зависит от особенностей обрабатываемых объектов, наличия аппаратуры. Медицинские предметы, не соприкасавшиеся с кровью, подвергаются только дезинфекции. Изделия, соприкасавшиеся с кровью, подвергаются дополнительно предстерилизационной обработке. Предстерилизационная обработка. Подвергаются изделия перед стерилизацией с целью удаления белковых и других загрязнений. Предстерилизационная очистка осуществляется ручным или механизированным способом. Обработка ручным способом: 1. Предварительное ополаскивание (0,5 мин). 2. Замачивание в моющем растворе (15 мин). 3. Мойка в моющем растворе (0,5-1 мин). 4. Ополаскивание проточной и дистиллированной водой. 5. Сушка в воздушных стерилизаторах (при температуре 80-85⁰ С). Механизированную обработку инструментов проводят в машинах. Контроль качества предстерилизационной очистки проводят путём постановки бензидиновой, ортолидиновой, аминопириновой (на скрытую кровь) и фенолфталеиновой (на остатки моющих средств). Паровая стерилизация. Насыщенный водяной пар под давлением является эффективным средством для уничтожения всех видов микроорганизмов. Стерилизация паровым методом осуществляется в паровых стерилизаторах. Паровой стерилизации подвергаются изделия медицинского назначения, соприкасающиеся с раневой поверхностью, кровью или инъекционными препаратами (изделия из текстиля, металла и стекла). В стерилизационную камеру предмета закладывают в стерилизационных коробках (биксах) или в двойном слое х/б ткани, или в пергаменте. Паровая стерилизация проходит в несколько этапов: 1. Водопаровую камеру заполняют водой. 2. В стерилизационную камеру закладывают вещи. 3. Подключают нагрев. 4. Доводят давление пара до заданного (начало стерилизационной экспозиции).

Давление	Температура	Выдержка
0,11 мПа	120⁰ С	45 минут
0,2 мПа	132⁰ С	20 минут

5. Снижают давление.

12 3 Следующая ⇒