ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ 3 страница

4.4.2. Методы лабораторного исследования.

В практике эпизоотологического исследования на туляремию основное место принадлежит бактериологическим методам, обеспечивающим выявление и выделение возбудителя туляремии. Вместе с тем, существенную роль приобретают серологические методы исследования, позволяющие с меньшими трудозатратами и в короткий срок дать заключение об эпизоотическом состоянии территории. В последние годы разработан и находит применение высокочувствительный метод ПЦР, позволяющий по обнаружению специфической ДНК судить о наличии возбудителя туляремии в пробе и выявлять "некультивируемые" формы микроорганизма.

Бактериоскопия. Ввиду очень мелких размеров туляремийный микроб может быть достоверно обнаружен в окрашенных мазках - отпечатках только из обильно обсемененного патологического материала. Четко положительные результаты получают при содержании в 1 г ткани более 1 млрд. микробов. Поэтому бактериоскопия эффективна при исследовании павших диких или биопробных животных, но обычно безуспешна при исследовании убитых на ранних стадиях заболевания зверьков. Метод не используется также при исследовании воды, смывов с объектов внешней среды, где концентрация возбудителя может быть незначительной.

Мазок - отпечаток делают, прикладывая к обезжиренному стеклу поверхность свежего среза исследуемого органа - лимфатического узла, селезенки, печени, а также мазок крови из сердца. Препарат хорошо просушивают, после чего 15 - 20 мин. фиксируют в 96°-ном этиловом спирте или смеси Никифорова (этиловый спирт и серный эфир в равных пропорциях). После фиксации мазок окрашивают по Романовскому - Гимзе. Раствор краски готовят из расчета 3 - 4 капли на 1 мл дистиллированной воды (рН 7,0 - 7,2). Окраска продолжается не менее 1 ч. (можно до 24 ч.). В правильно окрашенном мазке бактерии туляремии имеют сиреневый цвет и легко определяются по размерам, форме и тенденции к кучечному расположению.

С целью ускоренной окраски мазков применяют метод, основанный на одновременной фиксации и окраске мазка. Для этого краску Романовского - Гимзы смешивают в равных частях с метиловым спиртом (или химически чистым ацетоном). Смесь можно длительно хранить в посуде с притертой стеклянной пробкой. На свежий (не более двух суток), высушенный и нефиксированный мазок наносят 20 капель смеси. Через минуту к краске приливают 10 мл дистиллированной воды (рН 7,2). Осторожным покачиванием краску смешивают с водой. Через 10 - 15 мин. краску сливают, мазок промывают дистиллированной водой, высушивают и просматривают под микроскопом. Бактерии туляремии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет и четко дифференцируются от светло-сиреневого окружающего фона. Количество бактерий, обнаруженных в мазках - отпечатках из органов и крови, учитывают по 4-балльной шкале. Достоверным для диагностики является обнаружение туляремийных бактерий в количестве, оцениваемом в три или четыре балла (большое количество крупных, средних и небольших по величине скоплений бактерий в каждом поле зрения).

Люминесцентная микроскопия. В основе метода лежит реакция иммунофлуоресценции (РИФ) в ее прямом варианте. Люминесцентная микроскопия является эффективным методом обнаружения возбудителя туляремии, позволяющим выявлять как живые, так и мертвые туляремийные бактерии при концентрации 1 млн. м.к. в 1 мл. При меньших концентрациях - 100 тыс., 10 тыс. и 1 тыс. м.к. - в 1 мл возбудитель может быть обнаружен, но его выявление не носит закономерного характера. Реакция иммунофлуоресценции позволяет обнаружить туляремийные бактерии при отрицательном результате световой бактериоскопии. Объектами исследования в РИФ могут служить бактериальные взвеси, отпечатки органов и тканей животных, гомогенаты органов животных, беспозвоночных переносчиков. Метод используют для выявления возбудителя в органах павших и убитых биопробных животных, в трупах диких животных, органах отловленных диких животных. Метод прост в постановке, не имеет себе равного в быстроте получаемого ответа (1,5 - 2,0 ч.) и рекомендуется для ускоренного выявления и идентификации возбудителя туляремии. При приготовлении препаратов для РИФ на обезжиренном предметном стекле делают мазки - отпечатки из лимфатического узла, селезенки, печени, легкого или гомогенатов исследуемых органов. В последнем случае используют суспензию, приготовленную для биологической пробы или серологического исследования, делая по возможности тонкий мазок. Дальнейшие процедуры постановки РИФ и учета ее результатов проводят в соответствии с инструкцией по применению иммуноглобулинов диагностических флюоресцирующих туляремийных сухих.

Бактериологический метод. Посев на питательные среды применяют для выделения культуры возбудителя туляремии из органов павших или забитых диких животных, павших или убитых лабораторных животных, а также зверьков, у которых обнаружены патолого-анатомические изменения, характерные для туляремии. Иксодовых клещей, воду, почву, смывы с объектов внешней среды не исследуют посевом ввиду их загрязнения посторонней микрофлорой.

Возбудитель туляремии не растет на обычных питательных средах (мясо-пептонном агаре и бульоне), что служит одним из признаков при идентификации культуры. Наиболее практичной и обычно применяемой средой для выделения и культивирования туляремийного микроба является свернутая желточная среда.

Посевы могут быть произведены методом отпечатков кусочками органа или путем тщательного втирания кусочка органа по всей поверхности среды. При обильном засеве рост туляремийных бактерий на свернутой желточной среде появляется в виде сплошного роста уже через 18 - 24 ч. инкубирования при 37 °С; при засеве малым количеством бактерий отдельные колонии становятся заметными на 3 - 5 сутки и позднее. Посевы следует выдерживать в термостате до 10 - 12 суток. По внешнему виду рост туляремийных бактерий на свернутой желточной среде хорошо отличается от большинства других бактерий, имеет вид извилистого, слегка блестящего (не сухого), почти бесцветного нежного налета.

Для выделения и культивирования туляремийного микроба используют также агаровую среду с добавлением желтка. Среду готовят на основе сухого питательного агара: на 100 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до 45 °С агара добавляют 5 мл куриного желтка с 0,9%-ным раствором натрия хлорида (в соотношении 3:2).

Для культивирования туляремийных бактерий применяются различные варианты агаровых сред лабораторного изготовления на рыбных, мясных, дрожжевых основах с обязательным добавлением цистина (цистеина) 0,1%; глюкозы 1,0%; дрожжевого экстракта (источник витамина В). Чувствительность указанных агаровых сред можно повысить добавлением дефибринированной кроличьей или лошадиной крови (5 - 10%).

На свежей агаровой среде приживаются единичные бактерии, при этом формируются колонии, которые становятся заметными через 2 - 3 суток инкубации, редко - в более отдаленные сроки. Посевы следует выдерживать при 37 °С до 10 - 12 суток. При посеве взвеси из растертых тканей животного высокоэффективные агаровые среды позволяют обнаруживать единичные бактерии и не уступают биологической пробе. При исследовании трупов животных в первую очередь производят посев из селезенки, печени, лимфатического узла. При посеве из недостаточно свежих органов животных полезно использовать селективные добавки (СД). В качестве СД можно применять пенициллин (100 ед./мл), ампициллин (100 ед./мл), полимиксин (50 - 100 мкг/мл), кефзол (или цефалексин), амфотерицин В (или амфоглюкамин), ристомицин сульфат и некоторые другие.

Свернутая желточная среда Мак - Коя. Среду готовят из желтков куриных яиц, которые тщательно моют, протирают спиртом, обжигают на пламени горелки, разбивают, сливают желтки, отделяя их от белка, в стерильный градуированный сосуд, смешивают с 0,9%-ным раствором натрия хлорида (рН 7,0 - 7,2) в соотношении: 60% желтка и 40% раствора хлористого натрия. Жидкую среду разливают в пробирки по 4 - 5 мл и помещают в аппарат для свертывания сывороток при наклонном положении пробирок, чем достигают скашивания среды. Свертывание среды производят при 80 °С в течение 1 ч. Среду сохраняют при 4 - 6 °С, предохраняя от высыхания. Правильно приготовленная среда должна иметь на дне пробирки конденсационную жидкость. Приготовленную среду можно использовать в течение 1 месяца. При необходимости в среду добавляют СД.

Кровяная среда Емельяновой. Среду готовят на рыбно-дрожжевом гидролизате. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 20 мл гидролизата свежей рыбы, 10 мл гидролизата желатины, 2,5 мл аутолизата дрожжей, 0,5 г хлорида натрия, 1 г глюкозы, 0,1 г цистина (цистеина), 1,5 - 2,5 г агара (в зависимости от его качества); рН среды 7,0 - 7,2. После стерилизации в расплавленную, и охлажденную до 45 °С среду добавляют 10 мл свежей кроличьей или лошадиной дефибринированной крови, разливают в пробирки (или чашки) и скашивают. Правильно приготовленная кровяная среда хранится при 4 - 6 °С в течение 1 месяца. Однако в процессе хранения чувствительность среды постепенно снижается. При необходимости в среду одновременно с кровью добавляют (СД).

Разработаны и используются на практике питательные сухие агаровые среды для культивирования и выделения туляремийного микроба, содержащие все необходимые факторы роста и не требующие добавления крови (или желтка): питательная среда элективная для выделения возбудителя туляремии сухая (АДЭТ); питательная среда культивирования и выделения туляремийного микроба (FT); основа питательной среды для культивирования туляремийного микроба сухая и другие, разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке.

Биологический метод. Биологическая проба является самым эффективным способом обнаружения туляремийных бактерий в любом исследуемом материале. Биологическим методом можно исследовать органы павших или убитых диких млекопитающих, кровососущих членистоногих, гидробионтов, воду, смывы с различных субстратов, т.е. материалы, где могут содержаться живые туляремийные бактерии. Для биологической пробы обычно используют белых мышей, которые заболевают и гибнут от туляремии при подкожном введении суспензии, содержащей единичные бактерии. При массивном инфицировании исследуемых объектов мыши погибают уже на 3 - 4 сутки; при меньшей обсемененности материала гибель животных может затянуться до 7 - 9 суток, иногда до 15 - 20 суток. В большинстве случаев животные погибают от туляремии с характерными патолого-анатомическими изменениями: обнаруживаются воспалительные изменения ткани на месте заражения (плотный инфильтрат), увеличение, уплотнение и гиперемия лимфатических узлов, особенно близлежащих к месту заражения, резкая гиперемия сосудов подкожной клетчатки, уплотнение и увеличение селезенки, печени, увеличение и гиперемия надпочечников, гиперемия тонкого кишечника. В мазках - отпечатках из селезенки, печени и крови (при окраске по Романовскому - Гимзе или путем люминесцентной микроскопии) обнаруживают большое количество туляремийных бактерий, а в посеве на специальные питательные среды селезенки и печени уже через 18 - 24 ч. появляется рост культуры возбудителя туляремии. Для биологической пробы могут быть использованы и морские свинки, обладающие такой же высокой чувствительностью к туляремии, как и белые мыши, а также дикие грызуны 1-й группы (обыкновенные полевки, домовые мыши), отловленные на неэпизоотических территориях и выдержанные в карантине 30 суток. Биопробных животных содержат поодиночке. При гибели биопробных животных или обнаружении у забитых характерных для туляремии патолого-анатомических изменений осуществляют следующий пассаж через белую мышь (подкожным или накожным методами). Биопробных животных выдерживают: белых мышей до 15 - 21 суток, морских свинок - до 25 суток, после чего забивают.

Иммуносерологические методы исследования. Возможность исследования материала, не пригодного для бактериологического исследования, делает серологические методы в ряде случаев основным методическим приемом, позволяющим выявить туляремийные эпизоотии.

Все найденные трупы грызунов подлежат обязательному серологическому исследованию на наличие туляремийного антигена параллельно с биологическим и бактериологическим исследованием, включая люминесцентную микроскопию. Серологические методы особенно эффективны при поисках антигена в ПП, ПХМ, субстратах гнезд и других объектах внешней среды.

При исследовании трупов диких или лабораторных животных готовят суспензию из кусочков органов животных (селезенка, печень) путем растирания их в ступке с добавлением 0,9%-ного раствора натрия хлорида из расчета 1:5 или 1:10. Полученную суспензию обеззараживают в соответствии с п. 2.8.16 СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)", фильтруют (лучше через асбестовую вату) для получения относительно прозрачного фильтрата. Можно использовать остатки суспензии из органов, приготовленных для постановки биологической пробы.

Для исследования субстрата гнезда грызунов желательно брать его целиком вместе с прилегающими слоями почвы. Материал заливают 0,9%-ным раствором натрия хлорида с избытком (примерно 10 мл). Через 1 - 6 ч. надосадочную жидкость отсасывают, обеззараживают в соответствии с п. 2.8.16 СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)", фильтруют и используют в серологических реакциях.

Для серологического исследования бактериальной культуры

последнюю выращивают 2 суток при 37 °С на желточной

или агаровой среде, готовят взвесь на физиологическом растворе

(рН 7,0 - 7,2) с концентрацией 1 х 10 м.к./мл по оптическому

стандарту мутности, обеззараживают в соответствии с п. 2.8.16

СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II

групп патогенности (опасности)". Взвесь разводят в 10 раз до

концентрации 100 млн. м.к./мл и используют в серологических

реакциях.

Наиболее эффективной и специфичной серологической реакцией для выявления туляремийного антигена при исследовании органов животных, ПП, ПХМ, субстрата гнезд, почвы и тому подобного является реакция нейтрализации антител (РНАт) с туляремийным антигенным эритроцитарным диагностикумом. При массовых исследованиях ПП, ПХМ, других объектов внешней среды за диагностический титр принимают разведение фильтрата 1:20 и выше. Реакции в более низких титрах расценивают как сомнительные. При исследовании некоторых объектов (бактериальные суспензии, органы животных и др.) помимо РНАт можно применять иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию объемной агломерации (РОА), реакцию коагглютинации (РК) и некоторые другие методы, с успехом используемые в отдельных регионах и учреждениях.

Иммуноферментный анализ на твердофазном носителе (ИФА)

используется для выявления туляремийного антигена

в различных объектах: органы животных, ПП, ПХМ, другие

объекты внешней среды, а также для идентификации

выделенных культур возбудителя туляремии. Метод

характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью,

возможностью количественной и автоматизированной оценки

результатов, воспроизводимостью и стандартностью основных

ингредиентов анализа. С помощью ИФА возможно обнаружение

3 4

n х 10 - n х 10 туляремийных бактерий в 1 мл или 1 - 5

нг/мл туляремийного антигена.

Для постановки ИФА используют диагностическую иммуноферментную тест-систему для определения туляремийного антигена.

Наиболее эффективными и доступными методами выявления антител являются реакция агглютинации (РА) и реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Титры антител у переболевших диких животных колеблются в пределах 1:10 - 1:320, редко выше, в зависимости от давности заболевания. У сельскохозяйственных животных они могут достигать 1:320 - 1:640, но чаще бывают низкими. Наличие антител у животных указывает на контакт животного с возбудителем туляремии и наличие эпизоотии. Для выявления антител у животных могут быть использованы сыворотка, плазма или "смывы" из грудной полости.

Исследование методом ПЦР. В ряде случаев для определения ДНК возбудителя туляремии в различных объектах применяется ПЦР. Метод превышает по чувствительности серологические тесты и используется для индикации и ускоренной диагностики туляремии. Подготовку материала и проведение реакции осуществляют в соответствии с МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности" и инструкцией по применению препарата с использованием ПЦР-тест-системы для выявления ДНК возбудителя туляремии.

4.4.3. Идентификация возбудителя туляремии.

Идентификацию осуществляют на основании совокупности следующих признаков:

- морфологии и окраски бактерий в мазках и специфического свечения в РИФ;

- характера роста на свернутой желточной среде;

- отсутствия роста на простых питательных средах;

- агглютинации специфической туляремийной сывороткой;

- патогенности для белых мышей и морских свинок.

Выделенная культура должна иметь характерный для микроба туляремии рост на свернутой желточной среде в виде извилистого, слегка блестящего (не сухого) почти бесцветного налета не очень сильно выраженной слизистой консистенции, хорошо снимающегося петлей. Культура легко суспендируется. Для изучения морфологии и тинкториальных свойств готовят мазок на предметном стекле, который фиксируют и окрашивают по Граму. В мазке возбудитель туляремии представляет собой мелкую, грамотрицательную коккобактерию. В окрашенных мазках из культуры с плотной среды обнаруживается обильная слизь. Присутствие в мазке окрашенной слизи весьма характерно для возбудителя туляремии. Для проверки отсутствия роста на простых питательных средах используют слабощелочной питательный агар и бульон.

Антигенную специфичность выделенной культуры проверяют с

помощью реакции агглютинации с лошадиной (коммерческой)

агглютинирующей сывороткой. Для этого испытуемую культуру

выращивают в течение 2 суток при 37 °С на свернутой желточной

среде в количестве 2 - 3 пробирок. Чистоту посева контролируют

бактериоскопией. Реакцию агглютинации (РА) ставят общепринятым

способом в пробирках. В качестве антигена используют живую

испытуемую культуру, суспендированную в 0,9%-ном растворе натрия

хлорида (рН 7,0 - 7,2) до концентрации 1 х 10 м.к./мл по

оптическому стандарту мутности 10 единиц (ОСО 42-28-86П). После

добавления антигена к разведениям сыворотки пробирки выдерживают

2 ч. при 37 °С, затем 12 - 18 ч. при комнатной температуре, после

чего проводят учет результатов. Культура должна агглютинироваться

до титров, указанных в инструкции по применению препарата. При

этом должна иметь место четкая реакция, сопровождающаяся полным

просветлением жидкости и выпадением на дно пробирки плотного

агглютината. При встряхивании пробирки агглютинат разбивается на

крупные хлопья, а жидкость остается прозрачной. Специфичность

выделенной культуры может быть подтверждена также с помощью РИФ.

При обработке культуры туляремийной люминесцирующей сывороткой

обнаруживают специфическое яркое зелено-желтое свечение бактерий.

При возможности проводят проверку вирулентности выделенных

культур, но не позднее месячного срока после их выделения.

Ориентировочное определение вирулентности проводят, как правило,

на одном из двух видов животных (белые мыши или морские свинки).

Для заражения используют 2 дозы: 1 и 10 м.к. по 2 - 3 животных на

каждую дозу. Свежевыделенные туляремийные культуры при подкожном

введении вызывают гибель белых мышей (морских свинок) при дозе

1 м.к. с обнаружением характерных для туляремии изменений в

органах и выделением чистой культуры. При необходимости определяют

LD для лабораторных животных.

На территории Российской Федерации циркулируют и выделяются

культуры голарктического подвида возбудителя туляремии

F. tularensis subspecies holarctica, различающиеся по

чувствительности к эритромицину (и другим макролидам). Для

определения этого свойства используют диски с эритромицином,

содержащие 15 мкг антибиотика. Эта концентрация антибиотика

позволяет дифференцировать штаммы туляремийного микроба на два

биологических варианта: биовар I Ery(s) и биовар II Егу(r). Для

определения принадлежности к тому или иному биовару готовят

суспензию испытуемой культуры в концентрации 1 х 10 м.кл./мл по

оптическому стандарту мутности 10 единиц (ОСО 42-28-86П). Вносят

0,5 мл такой суспензии на чашку с агаровой средой, равномерно

распределяя по поверхности, после чего накладывают в центральную

часть чашки диск с эритромицином. Чашку помещают в термостат при

37 °С. Учет и оценку результатов производят через 1 - 2 суток. При

посеве чувствительной к эритромицину культуры вокруг диска с

антибиотиком обнаруживают выраженную зону задержки роста диаметром

2 - 3 см; при посеве культуры, резистентной к эритромицину, по

всей поверхности чашки отмечается равномерный рост.

5. Лабораторная диагностика туляремии у людей

Лабораторная диагностика туляремии у людей основывается на иммунологических (сероаллергическая диагностика) и бактериологических методах.

5.1. Аллергические и серологические методы

Аллергические и серологические методы играют основную роль в лабораторной диагностике туляремии.

В патогенезе туляремийной инфекции значительную роль играет развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), выявление которой может служить методом аллергической диагностики туляремии. Метод основан на особенностях организма человека, заболевшего или переболевшего туляремией, отвечать местной аллергической реакцией в виде гиперемии и инфильтрата на введение туляремийного антигена (тулярина). У больных туляремией людей кожная аллергическая реакция становится положительной обычно с 3 - 5 суток болезни, реже - в более поздние сроки, и сохраняется многие годы, благодаря чему аллергический метод служит для ранней или ретроспективной диагностики, являясь при этом строго специфичным. У привитых живой вакциной также возникает аллергическая реактивность, но она развивается медленнее (через 10 - 15 дней после вакцинации). Аллергический ответ у вакцинированных сохраняется 5 - 6 лет, иногда дольше, и может служить методом определения сохранности поствакцинального иммунитета. Кожную аллергическую реакцию выполняют как накожно, так и внутрикожно с соответствующим тулярином. Следует помнить, что аллергическая реакция на введение антигена - это общая реакция организма, которая при развившемся инфекционном процессе может вызвать ухудшение состояния больного, а местная реакция иногда сопровождается некрозом. Поэтому в качестве диагностического приема у больных людей пробу с тулярином применяют с осторожностью.

Для внутрикожной пробы применяют внутрикожный тулярин - взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70 °С в течение 1 ч. Взвесь готовят на 0,9%-ном растворе натрия хлорида, содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата содержится 500 млн. убитых бактерий. Выпускают препарат в запаянных ампулах, содержащих 1 мл препарата (или 10 человеко-доз). Препарат предназначен в первую очередь для диагностики туляремии.

Тулярин в количестве 0,1 мл вводят стерильным шприцем строго внутрь кожи левого предплечья (на границе верхней и средней трети). Кожу предварительно обрабатывают спиртом и эфиром. На месте введения препарата образуется беловатый пузырек диаметром 3 - 4 мм, который примерно через 30 мин. рассасывается.

Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 24 - 48 ч. путем осмотра и ощупывания участка кожи, куда был введен тулярин. При положительной реакции на месте введения тулярина уже через 6 - 10 ч. обнаруживаются покраснение (гиперемия) и отек (инфильтрат). Через 24 ч. реакция кожи выражена вполне отчетливо и имеет вид гиперемированного, нередко болезненного инфильтрата. Реакцию считают положительной при наличии инфильтрата и гиперемии диаметром не менее 0,5 см. Интенсивность реакции определяют по величине реагирующего участка (отека и гиперемии) кожи, который измеряют в сантиметрах в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Изменения кожи в виде гиперемии без инфильтрата, исчезающие через 48 ч., расценивают как отрицательный результат. В сомнительных и подозрительных случаях возможна повторная постановка реакции, т.к. отрицательный результат мог быть обусловлен ранним сроком от начала заболевания. Так, аллергическая реакция может запаздывать при тяжелых формах инфекции. Запаздывание реакции может также иметь место при раннем применении антибиотиков для лечения больного. В ряде случаев аллергическая реакция сопровождается образованием пустулы или кратковременным лимфангоитом с незначительным увеличением регионарных лимфатических узлов и повышением температуры тела на 1 - 1,5 °С в течение 1 - 2 дней. Известны редкие случаи образования некроза на месте инъекции тулярина. В этой связи для диагностики туляремии предпочтительнее использовать аллергические методы in vitro или серологические методы.

Для накожной пробы применяют накожный тулярин - взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70 °С в течение 1 ч. Взвесь готовят в 0,9%-ном растворе натрия хлорида, содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата содержится 10 млрд. убитых бактерий. Выпускают препарат в запаянных ампулах, содержащих 1 мл, что составляет 20 человеко-доз. Препарат предназначен в первую очередь для определения иммунитета у привитых против туляремии или для ретроспективного обследования.

Перед употреблением ампулу с накожным тулярином встряхивают до образования равномерной взвеси. Одну каплю тулярина глазной пипеткой наносят на обработанную спиртом и эфиром кожу наружной поверхности левого плеча в его средней трети. Через каплю стерильным скарификатором делают две параллельные насечки длиной 8 - 10 мм, соблюдая расстояние между насечками 5 мм, до появления росинок крови. Затем тулярин тщательно втирают в насечки плоской стороной скарификатора в течение 1 мин. Тулярин применяют немедленно после вскрытия ампулы.

Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 48 - 72 ч. Положительная реакция выражается отечностью кожи вокруг насечек и краснотой, которые иногда появляются уже через 24 ч после введения тулярина, через 48 - 72 ч. реакция ярко выражена и далее постепенно угасает, полностью исчезая к 7 - 10 дню. Диаметр реагирующего участка достигает 1 - 2 см. В редких случаях по ходу насечек появляются везикулы, исчезающие через 2 - 3 дня. Реакцию считают положительной при величине реагирующего участка кожи не менее 0,5 см и наличии вдоль насечек ясного покраснения и небольшой отечности (валик). При правильной технике постановки накожная туляриновая проба по чувствительности не уступает внутрикожной, но в отличие от последней не сопровождается повышенными местными или общими реакциями. Категорически запрещается накожный тулярин вводить внутрикожно или подкожно, т.к. он может вызвать бурную местную и общую реакции.

Реакция лейкоцитолиза (РЛ) основана на учете разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического аллергена (антигена), регистрируемого методом in vitro. Реакция лизиса лейкоцитов становится положительной уже в первые дни после вакцинации или заболевания (3 - 4 день), удерживается в течение многих лет (у переболевших - до 40 лет). На 7 - 15 день после вакцинации показатели лизиса лейкоцитов составляют, в среднем, 49 - 50%, затем постепенно снижаются, но даже через 1 - 5 лет после вакцинации иногда остаются на достаточно высоком уровне (30 - 31%). РЛ обладает строгой специфичностью, дает возможность количественного учета степени сенсибилизации организма, позволяет получить ответ через несколько часов после взятия крови.

В две лунки полистироловой пластины вносят по 50 мкл 10%-ного раствора натрия цитрата, затем в первую (опытную) лунку добавляют 50 мкл антигена (накожного тулярина, содержащего 1,10 (в степени 10) бактерий в 1 мл)), а во вторую (контрольную) - 50 мкл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Таким образом, в обеих лунках конечная концентрация цитрата натрия составляет 5%. Кровь для исследования берут из пальца руки и в количестве 100 мкл вносят в каждую из двух лунок. Пластинку закрывают и помещают на 2 ч. в термостат при температуре 37 °С. Кровь в лунках тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Затем по 20 мкл крови из обеих лунок поочередно забирают с помощью микропипеточного дозатора и переносят в соответствующие лунки планшета для макроагглютинации, содержащие 0,4 мл 3%-ной уксусной кислоты, подкрашенной до светло-голубого цвета с помощью метиленовой синьки.

Количество лейкоцитов подсчитывают в крови из обеих лунок в камере Горяева. Разрушенные клетки, а также клетки, собирающиеся в кучки, не учитывают. Коэффициент лейкоцитолиза вычисляют по формуле:

M - М

к 0

K% = ------- х 100,

где:

М - количество лейкоцитов в опыте (первая лунка);

М - количество лейкоцитов в контроле (вторая лунка).

Для оценки результатов используют следующую шкалу показателей:

⇐ Предыдущая 1 234 5 6 Следующая ⇒