3.1.1. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. 4 страница

--------------------------------

< *> Высеваемость иерсиний наиболее высока в первые 3 - 5 дней болезни и до назначения антибиотиков.

< 1> Кол-во указано в соответствии с требованиями СанПиН 2. 3. 2. 1078-01 " Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".

Схема проведения бактериологического исследования включает " обогащение" исследуемого материала при низкой температуре, использование дифференциально-диагностических сред для выделения и идентификации культур, определение их биотипа, серотипа, вирулентности.

Несмотря на низкую эффективность, прямой посев нативного материала на плотные питательные среды проводят, как правило, при подозрении на инфицированность иерсиниями продуктов питания и/или при групповых заболеваниях, вызванных употреблением (инфицированных) продуктов. Для этой цели эффективнее применение дифференциально-диагностической среды для выделения иерсиний с бромтимоловым синим (СБТС).

При проведении " холодового обогащения" исследуемый материал в пептонно-калиевой среде (ПК) помещают в холодильник и выдерживают в нем до первого положительного посева, но не более 10 дней.

Высев на плотные питательные среды проводят со среды ПК на 2 - 3, 5 - 7 и 10 сутки. Высевы производят петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности). Перед посевом содержимое пробирок не взбалтывают. При использовании среды Эндо и/или исследовании загрязненных проб, особенно при массовом поступлении, для ингибирования роста посторонней флоры проводят щелочную обработку. Методика щелочной обработки основана на относительной резистентности иерсиний к щелочи по сравнению с другими микроорганизмами.

Методика щелочной обработки

Щелочная обработка проб проводится перед каждым высевом со среды ПК на плотную питательную среду. В лунки полистироловых планшетов для иммунологических реакций вносят по 0, 2 мл свежеприготовленного 0, 72% раствора KOH в 0, 5% растворе NaCl и 0, 2 мл исследуемого материала, перемешивают, выдерживают 1 - 1, 5 минуты и высевают на СБТС или среду Эндо. Посевы инкубируют при (26 +/- 2) °С.

Просмотр выросших колоний проводят, как правило, через 48 ч, учитывая их морфологию (таблица 5).

Таблица 5

ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛОНИЙ ИЕРСИНИЙ

НА ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

Вид	Среда Эндо		Среда Хоттингера		СБТС		Примечание
Вид	24 часа	48 часов	24 часа	48 часов	24 часа	48 часов	Примечание
Yersinia pseudo- tubercu- losis	Колонии мелкие (росин- чатые) круглые, выпу- клые, блестя- щие, бес- цветные	Колонии диаметром 0, 1 - 0, 2 мм, крупные, выпуклые, блестящие с ровными краями, бесцвет- ные	Колонии диаметром 0, 1 - 0, 2 мм, голубовато-белые полупрозрачные с ровными краями, слизистые со слабоприподнятым центром (под микроскопом имеют вид пирамид или со сходящимися к центру гранями)	Колонии диаметром 0, 2 - 0, 5 мм, прозрачные с ровным краем. В полиморфной популяции - часть колоний бугристая с неровными фестончатыми краями	Колонии мелкие круглые, могут иметь слегка желто- ватую окраску	Колонии диамет- ром 1 - 2 мм, голубовато- зеленоватые, с фестончатыми краями, выпук- лые с приподня- тым центром и суховатой мато- вой поверхно- стью на синем фоне среды	На СБТС через 48 ч колонии E. coli - ярко- желтые, диаметром 2 - 3 мм, сочные, выпуклые; Sh. flexneri - желтые, диаметром 1 - 2 мм, сочные, плоские
Yersinia entero- colitica	Такие же	Такие же, но с розоватым оттенком	Колонии диаметром 0, 1 - 0, 2 мм до 0, 5 мм, круглые, выпуклые с ровным краем, полупроз- рачные с голубова- тым оттенком мяг- кой консистенции	Колонии диаметром 0, 3 - 0, 5 мм, более выпуклые с ровным краем, прозрачные		Колонии диамет- ром 2 - 4 мм, голубовато- зеленоватые, выпуклые, сухие, с матовым налетом

Биохимическая идентификация

Видовую принадлежность выделенных культур устанавливают на основании комплекса типичных морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и других свойств.

Для предварительного отбора используют стабильный биохимический признак - наличие уреазы. Положительный уреазный тест позволяет отличить иерсиний от других видов патогенных кишечных бактерий - шигелл, сальмонелл, эшерихий и др. Отсев подозрительных колоний проводят на скошенный столбик среды Олькеницкого штрихом и уколом в столбик. Как и иерсинии, бактерии рода Proteus гидролизуют мочевину, но они, в отличие от Yersinia, всегда расщепляют триптофан.

Ферментативная активность исследуется обычным способом на средах Гисса при 28 °С; подвижность в 0, 3% полужидком агаре и реакция Фогес-Проскауэра (среда Кларка) - при 25 и 37 °С.

Y. pseudotuberculosis отличаются от Y. enterocolitica по отношению к сахарозе и рамнозе.

Тесты расширенного биохимического ряда - ферментация ксилозы, сорбита, салицина и образование индола - позволяют определить биотип Y. enterocolitica.

В таблице 1 приведены основные биохимические тесты, позволяющие дифференцировать иерсиний от других микроорганизмов, имеющих с ними сходство, а также определить их видовую принадлежность и биотип Y. enterocolitica.

Серологическая идентификация

Серотипированию подлежат культуры, отнесенные по биохимическим свойствам к виду Y. enterocolitica и/или Y. pseudotuberculosis. Ее проводят с помощью реакции агглютинации на стекле по общепринятой методике с диагностическими сыворотками к Y. enterocolitica серогрупп: О: 3; О: 4; О: 4, 32; О: 4, 33; О: 5; О: 5, 27; О: 6, 30; О: 6, 31; О: 7, 8; О: 9; О: 13; О: 13, 7 и другие; к Y. pseudotuberculosis серотипов I и III.

Идентификация вирулентных иерсиний

Среди методов обнаружения вирулентных иерсиний для рутинной практики, наиболее адекватными являются:

1. Фенотипические методы, основанные на выявлении признаков вирулентности, связанных с функционированием плазмиды pYV 42 - 48 МДа, прежде всего аутоагглютинации и кальцийзависимости роста иерсиний.

Определение способности к аутоагглютинации

Феномен аутоагглютинации проявляется при культивировании в жидкой среде и состоит в спонтанном склеивании клеток иерсиний.

6 8

Для посева используют чистые культуры иерсиний. Засевают 10 - 10

кл/мл в 2 пробирки со средой Кларка, одну из которых инкубируют при

температуре (37 +/- 1) °С, другую - при (26 +/- 2) °С в течение 24 - 48 ч.

При положительном результате pYV+ иерсинии образуют рыхлый хлопьевидный осадок в первой пробирке (при (37 +/- 1) °С); во второй пробирке - равномерное помутнение, осадок чаще небольшой, компактный. При отрицательном результате рост pYV- иерсиний создает в обеих пробирках равномерное помутнение среды, хлопья отсутствуют.

Определение кальцийзависимости роста иерсиний

Данное свойство проявляется в ограничении роста бактерий

(бактериостаз), наступающем при дефиците ионов Ca. Определение проводят

на модифицированной среде АГВ (кальцийдефицитный агар) при температуре (37

+/- 1) °С. Исследуемые культуры инкубируют на бульоне Хоттингера при (26

+/- 2) °С в течение 24 ч, затем засевают на две чашки с кальцийдефицитным

агаром, одну из которых инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С, другую -

при (26 +/- 2) °С в течение 48 ч.

При положительном результате pYV+ колонии, выросшие при температуре (37 +/- 1) °С, значительно мельче (до 1 мм), чем при (26 +/- 2) °С, или отсутствуют (чаще у возбудителя псевдотуберкулеза). При отрицательном результате размеры pYV-колоний как при (37 +/- 1) °С, так и при (26 +/- 2) °С такие же, как на обычных средах.

При идентификации вирулентных иерсиний в качестве контрольных рекомендуется использовать референтные плазмидосодержащие штаммы Y. enterocolitica серотипов О: 3; О: 9 (N 188 в коллекции ГИСК им. Л. А. Тарасевича и N КМ-33 (201) в коллекции РосНИПЧИ " Микроб" ).

2. Специфический агглютинационный тест, основанный на использовании антител к антигенам вирулентности иерсиний (БНМ), детерминируемым плазмидными генами.

Реакция агглютинации (РА) на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям (СВИ) является экспресс-методом, позволяющим дифференцировать вирулентные pYV+ штаммы представителей рода Yersinia от авирулентных. Для постановки РА используют свежевыделенные культуры. Исследуемую культуру выращивают на чашке Петри или в пробирке со скошенным агаром Хоттингера при (37 +/- 1) °С в течение 18 - 24 ч и столько же при (26 +/- 2) °С. Далее постановка и учет реакции осуществляются по общепринятой методике (изложена в инструкции по применению).

КонсультантПлюс: примечание.

Нумерация пунктов дана в соответствии с официальным текстом документа.

4. 4. Иммунологические методы выявления

специфических антигенов

Методы, направленные на выявление специфических антигенов, являются наиболее перспективными для ранней диагностики инфекций, обусловленных иерсиниями. Основное их преимущество - быстрота получения результатов при высокой чувствительности.

В настоящее время для выявления антигенов иерсиний в различных субстратах используются:

- " Диагностикумы коагглютинирующие псевдотуберкулезные и иерсиниозные" для реакции коагглютинации (РКоА), предназначенные для выявления микробных антигенов, а при подращивании - живых возбудителей в материале от больных (испражнения, моча, слюна) на первой неделе болезни, а также антигенов, связанных в составе иммунных комплексов.

- Диагностикум латексный для выявления Yersinia pseudotuberculosis " Псевлат" для реакции агглютинации латекса (РАЛ). Реакцию используют для выявления антигенов возбудителя псевдотуберкулеза в копрофильтратах больных и в смывах с объектов внешней среды.

- " Тест-система иммуноферментная для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза I серотипа".

Материал для исследования, сроки и правила его взятия представлены в таблице 4 (аналогично подготовке материала для бактериологического метода).

Исследования проб проводят в первые сутки их получения и затем на 3 - 5 сутки после подращивания при 4 °С в ПК среде. Непосредственно перед исследованием материал инактивируют 30 мин. при (56 +/- 1) °С, центрифугируют при 3000 об. /мин. 15 мин. и берут для исследования надосадочную жидкость. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.

4. 5. Молекулярно-генетические методы

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет выявить генетические детерминанты, локализованные на плазмиде вирулентности pYV или хромосоме, кодирующие ряд факторов патогенности.

Основная трудность ПЦР заключается в том, что при исследовании биологического материала и объектов окружающей среды реакция может ингибироваться биологическими продуктами деградации тканей, ферментами, полисахаридами и другими компонентами исследуемого материала. Поэтому перед постановкой реакции необходимо подготовить пробы к исследованию (т. е. выделить тотальную ДНК).

Подготовка проб

Кровь. 50 мкл нативной крови смешивают со 100 мкл лизирующего буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8, 0, 0, 5% Твин-20, 100 мкг/мл протеиназы К) и инкубируют 1 ч при 56 °С, затем протеиназу К инактивируют 10 мин. при 95 °С, смесь центрифугируют 3 мин. при 5000 об. /мин. Для анализа в ПЦР достаточно 2 - 3 мкл надосадочной жидкости.

Моча. 10 - 20 мл мочи центрифугируют 10 мин. при 2000 об. /мин. К осадку добавляют 300 мкл стерильной дистиллированной воды и прогревают при 100 °С 10 мин. Центрифугируют при 5000 об. /мин. Для исследования в ПЦР берут 1 - 3 мкл надосадочной жидкости (38).

Вода. 1, 0 - 2, 0 л воды фильтруют через 0, 22 мкм бумажный фильтр. Затем фильтр измельчают и погружают в 300 мкл метанола на 15 мин. После высушивания под вакуумом к измельченному образцу добавляют 300 мкл стерильной дистиллированной воды, прогревают при 100 °С 5 мин., центрифугируют при 5000 об. /мин. 5 мин. Для исследования в ПЦР берут 1 - 3 мкл надосадочной жидкости.

Испражнения, помет грызунов, тонкий кишечник грызунов, смывы с объектов окружающей среды, почва. Подготовка материала основана на использовании щелочной обработки, при котором большая часть индигенной микрофлоры погибает и удаляется как супернатант при центрифугировании, а относительно устойчивые к щелочи иерсинии выживают, что обеспечивает снижение концентрации ингибиторов в пробе:

1. Исследуемый материал суспендируют в ФБР в соотношении 1: 10 и центрифугируют при 500 - 1000 об. /мин. 1, 5 - 2 мин. для осаждения грубых частиц или отстаивают 2 - 3 ч при комнатной температуре;

2. 0, 2 - 0, 5 мл верхней фазы переносят в лунку полистиролового планшета для серологических реакций и смешивают с таким же объемом 0, 72% KOH;

3. После 25 - 30 с экспозиции проводят посев материала на СБТС и сразу же в лунки планшета добавляют 0, 2 - 0, 5 мл бульона Хоттингера для прекращения действия щелочи как селективного агента;

4. Материал из лунки переносят в пробирку типа " Эппендорф" и центрифугируют на микроцентрифуге при 10000 - 12000 об. /мин. 3 - 5 мин.;

5. Надосадочную жидкость удаляют, осадок дважды центрифугированием промывают дистиллированной водой;

6. К осадку добавляют 20 мкл деионизованной воды, прогревают 10 мин. при 100 °С, центрифугируют при 12000 об. /мин. 2 мин. Для ПЦР используют 1 - 3 мкл надосадочной жидкости.

Пищевые продукты гомогенизируют в ЗФР в соотношении 1: 10, тщательно перемешивают в течение 15 мин., центрифугируют при 12000 об. /мин. 10 мин., осадок суспендируют в 300 - 500 мкл дистиллированной воды и проводят дальнейшую обработку в соответствии с п. 2.

Постановку ПЦР осуществляют согласно наставлениям к наборам для ПЦР " Амплисенс(R) Yersinia pseudotuberculosis" и " Амплисенс(R) Yersinia enterocolitica".

Для учета результатов ПЦР проводят электрофорез в 1, 5% агарозном геле. После окрашивания этидий бромидом гель просматривают в трансиллюминаторе с длиной волны ультрафиолетового излучения 310 нм. Образовавшиеся в результате реакции амплифицированные фрагменты ДНК (полосы в геле, светящиеся в УФ-лучах) идентифицируют по размеру, сравнивая с маркером молекулярного веса или положительным контролем.

Использование ПЦР дает возможность получить сигнальный результат в течение 1-х суток исследования, а наиболее короткий срок выделения культуры и идентификации иерсиний составляет 5 - 8 суток.

ПЦР-анализ можно использовать при 3-этапном варианте бактериологического исследования.

1 этап:

Подготовка проб: 100 мкл

1 г материала + 9 мл ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ > подготовка ─ ─ ─ ─ > Проведение ПЦР,

ЗФР (1: 10). проб для электрофорез,

Суспендировать, ПЦР получение результата

грубые частицы осадить через 4 - 6 часов

в центрифуге при после поступления

1000 об. /мин. - 30 с материала

│

2 этап

(3-и сутки) ─ ─ ─ ─ > щелочная ─ ─ ─ ─ > подготовка ─ ─ ─ ─ > Проведение ПЦР,

холодовое обработка проб для получение результата

обогащение │ ПЦР на 3-и сутки после

│ поступления

\/ материала

бактериологический

высев

3 этап

(5-е сутки).

Учет результатов

бактериологического

исследования,

выделение и

идентификация культур

Двукратно ПЦР - отрицательные анализы позволяют прекращать дальнейшее бактериологическое исследование.

КонсультантПлюс: примечание.

Нумерация пунктов дана в соответствии с официальным текстом документа.

6. Серологические методы

Общие правила постановки серологических реакций

Антитела к возбудителям псевдотуберкулеза и иерсиниоза появляются в крови уже на первой неделе болезни, а существенное повышение их уровней происходит к началу 3-й недели. Этими сроками регламентировано обязательное исследование парных сывороток крови. Через 2 месяца часто наблюдается снижение концентрации антител, а через 6 месяцев они могут обнаруживаться в минимальных значениях (1: 50; 1: 100).

Наиболее выраженная динамика антителообразования наблюдается у больных с заболеванием средней тяжести. При легком течении, особенно при абдоминальной форме, динамика антител выражена слабо, титры антител начинают регистрироваться в диагностических значениях не ранее второй недели заболевания.

В связи с наличием у иерсиний перекрестно реагирующих антител предложен учет минимального диагностического титра в РА и РНГА, равный 1: 160 и 1: 200 соответственно. Достоверным считается 2 - 4-кратное и выше нарастание титра антител при исследовании парных сывороток.

Реакция агглютинации (РА)

Для постановки РА используют стандартные иерсиниозные антигены распространенных серотипов, представляющие собой 10 млрд. взвесь иерсиний эталонных штаммов в S-форме, убитых формалином и суспендированных в 0, 9% растворе хлорида натрия. Перед постановкой антигены разводят 1: 10 (рабочая концентрация 1 млрд. ). Реакцию ставят методом равных объемов. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.

Реакция непрямой гамагглютинации (РНГА)

Для постановки РНГА используют стандартные эритроцитарные диагностикумы к Y. pseudotuberculosis I серотипа и Y. enterocolitica серотипов О: 3 и О: 9, представляющие собой полисахаридные антигены иерсиний, фиксированные на поверхности формалинизированных бараньих эритроцитов.

В связи с тем, что срок годности эритроцитарных диагностикумов составляет 3 года, необходима периодическая (не реже 1 раза в квартал) проверка их активности. Ее проводят с контрольной псевдотуберкулезной сывороткой с известным титром иерсиниозных антител. Если диагностикум выявляет в сыворотке антитела в концентрации на 3 разведения ниже, чем они в ней содержатся, то такой препарат не пригоден для дальнейшего использования.

Методика постановки и учета РНГА приведена в инструкции по применению.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Для постановки ИФА используют тест-системы " Иерсиниоз-ИФА-IgA", " Иерсиниоз-ИФА-IgM", " Иерсиниоз-ИФА-IgG", предназначенные для выявления антител классов A, M и G к возбудителям кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Высокая чувствительность и специфичность метода достигается благодаря использованию в качестве антигенов, сорбированных на поверхности стрипов, нескольких рекомбинантных белков наружной мембраны иерсиний. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.

Приложение 3

СРЕДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ПЕРВИЧНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ КУЛЬТУР

Жидкие среды накопления:

Пептонно-калиевая среда (ПК < 2> )

--------------------------------

< 2> Состав среды защищен патентом.

Состав среды: пептон ферментативный - 10, 0 г

двузамещенный фосфорнокислый калий (K HPO ) - 1, 0 г.

2 4

Способ приготовления: компоненты вносят в 1, 0 л дистиллированной воды, кипятят, помешивая, 2 - 3 мин., доводят рН до 7, 6 - 7, 8. Среду стерилизуют автоклавированием при 0, 5 атм. 20 мин. Хранят при 4 - 7 °С в течение 7 - 10 дней.

Среда для подавления роста посторонней микрофлоры:

Готовят растворы:

40% KOH (40 г KOH на 100 мл дистиллированной воды)

0, 5% NaCl (0, 5 г NaCl на 100 мл дистиллированной воды).

Растворы стерилизуют автоклавированием при 0, 5 атм. 30 мин., хранят при 4 - 7 °С.

Рабочую концентрацию среды готовят, смешивая 10, 0 мл 0, 5% раствора NaCl и 0, 18 мл 40% раствора KOH. Среда не подлежит хранению.

Плотные питательные среды:

Дифференциально-диагностическая среда для выделения иерсиний (СБТС < 3> ), рН 7, 8.

--------------------------------

< 3> Состав среды защищен патентом. Аналог выпускает ГосНИИ прикладной микробиологии (пос. Оболенск, Московская обл. ).

Состав среды: питательный агар для культивирования микроорганизмов -

35, 0 г

желчь очищенная - 6, 0 г

глюкоза - 10, 0 г

мочевина - 5, 0 г

бромтимоловый синий воднорастворимый - 0, 128 г

двузамещенный фосфорнокислый калий (K HPO ) - 1, 0 г.

2 4

Способ приготовления: компоненты вносят в 1, 0 л дистиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят 5 мин. на медленном огне. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр, вновь кипятят 1 - 2 мин., охлаждают до 45 - 50 °С и разливают в чашки Петри. Хранят среду в течение 7 - 10 дней при 4 - 7 °С.

Приложение 4

СРЕДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУЛЕНТНЫХ ИЕРСИНИЙ

Среда Кларка для определения аутоагглютинации:

Состав среды: двузамещенный фосфорнокислый калий (K HPO ) - 5 г

2 4

пептон - 7 г

глюкоза - 5 г

вода - до 1 л.

Способ приготовления: пептон и фосфат растворяют в воде и кипятят 2 - 5 мин. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют автоклавированием при 1 атм. в течение 20 мин., асептично добавляют стерильный раствор глюкозы и разливают по 3 - 5 мл в пробирки.

Среда для определения кальцийзависимости (кальцийдефицитный агар):

Готовят растворы:

0, 25 М щавелевокислого натрия (33, 5 г на 1 л дистиллированной воды)

0, 5 М хлорида магния (101, 5 г на 1 л дистиллированной воды).

Растворы стерилизуют автоклавированием при 0, 5 атм. 30 мин., хранят при 4 - 7 °С.

В качестве питательной основы используют среду АГВ. В 100 мл расплавленной среды (около 50 °С) асептично вносят 8 мл 0, 25 М раствора щавелевокислого натрия, тщательно перемешивают; добавляют 4 мл 0, 5 М раствора хлорида магния (указанная последовательность внесения солей обязательна). После перемешивания готовую среду разливают по 15 - 20 мл в чашки Петри. Хранят среду в течение 7 - 10 дней при 4 - 7 °С.

Приложение 5

НОРМАТИВНЫЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

1. Федеральный закон " О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ.

2. Постановление Правительства Российской федерации от 24 июля 2000 г. N 554 " Об утверждении Положения о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации и Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании".

3. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных (11. Иерсиниозы). Санитарные правила СП 3. 1. 094-96. Ветеринарные правила 13. 3. 1318-96.

4. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1. 2. 731-99 " Безопасность работы с микроорганизмами III и IV групп патогенности и гельминтов".

5. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3. 5. 3. 1129-02 " Санитарно-эпидемиологические требования к проведению дератизации".

6. Методические указания МУ 1. 3. 1888-04 " Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III и IV групп патогенности".

7. Методические указания МУ 3. 5. 5. 1034-01 " Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности при работе методом ПЦР".