7) Клонирование

1) Молекулярно-генетические методы(мгм) позволяют анализировать фрагменты днк, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты, а также устанавливать в них последовательность нуклеотидов.

Основные мгм:

Получение образцов днк. Вкл в себя выделение всей днк из клетки или ее определенных фрагментов. Источник – любые ядросодержащие клетки (капля крови, лейкоциты, соскоб эпителия со слизистой оболочки). Выделенное днк может долго храниться в замороженном состоянии.

Амплификация (получение большого количества копий) фрагментов днк – с использованием пцр. Проводится в лабораториях с использование днк-амплификатора.

Рестрикция (разрезание) днк на фрагменты осущ бактериальными эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами), разрезают днк в строго определенных местах.

Электрофорез фрагментов днк – разделение фрагментов днк в агарозном геле. Проводится с помощью спец устройства – электрофоретической камеры. Камера имеет электроды с разными полюсами, заполняется агарозным гелем и в гель, в области отрицательного электрода вводится образцы содержащие фрагменты днк. Под действием постоянного электрического поля происходит разделение фрагментов днк в зависимости от их размеров и молекулярной массы. Электрофорез днк используется при различных методах молекулярно-генетической диагностики.

Секвенирование днк определение нуклеотидной последовательности фрагментаили целой молекулы днк. Секвенирование днк наиболее затратный метод исследования днк, проводится с использование спец прибора – генетического анализатора (секвенатора)

2) Выделение днк. Днк выделяется из любого типа клеток или тканей, содерж ядра.

Этапы выделения днк:

· Лизис (разрушение) клеток – механическим путем

· Ферментативное разрушение белков

· Центрифугирование – ядра остаются в осадке, а постороннее всплывает

· Экстрагирование днк фенолом или хлороформом

· Осаждение днк этанолом

3) Пцр – увеличение днк в пробе. После выделения днк подвергается пцр для увеличения количества днк (амплификация)

Все методы:

· Пцр – полимеразная цепная реакция для увеличения кол-ва днк.

· Пдрф –полиморфизм длин рестрикционных фрагментов – исп для опр отцовства и др родственных связей, идентификация личности при неопознанном трупе, в диагностике наследственных заболеваний.

Пцр – изобрел в 1983 г амер мол ген Мюллис, в наст время яв самым точным методом диагностики. В основе метода лежит увеличение количества днк или ее фрагментов. Пцр исп для диагностики наследственных заболеваний, диагн инфек заб, клонировании генов, выявление мутаций.

Проведение пцр. Основные компоненты необходимые для проведения пцр:

· Днк – матрица (очищенная биопроба)

· 2 праймера комплементарные концам требуемого искомого фрагмента

· Термостабильная днк-полимераза

· Ионы магния (2)

· Буферный р-р.

Ход реакции:

· Денатурация днк матрицы. Смесь нагревают до 90-94 гр. Высокая температура разделяет цепи днк, образуя одноцепочную днк (2минуты)

· Стадия отжима, температура снижается на 3-4 гр, добавляются праймеры, для указания границ необходимого фрагмента (2минуты)

· Элонгация ()010-15 минут добавляется днк-полимераза, которая взаимодействует с днк-затравкой(праймер). Далее элонгация – наращивает фрагмент на 1 нуклеотид. Заканчивается дойдя до второго праймера.

Далее идет интерпретация результатов. н/р, в анализируемом образце найден фрагмент днк специфичный для искомого возбудителя или не найден.

4) Секвенирование – последний этап молекулярного анализа предварительно отобранного, клонированного и протестированного более простыми методами фрагмента днк. С-е п/с опр нуклеотидной последовательности фрагмента днк, путем получения серии комплементарных молекул днк, различающихся по длине на одно основание.

Этапы с- я:

· Гибридизация изучаемого фрагмента днк с праймером.

· Ферментативный синтез днк

· Денатурация полученных продуктов формамидом

· Электрофорез в полиакриламидном геле на 4-х дорожках

· Анализ результатов на радиоавтографе.

На большинстве радиоавтографах можно различить 250-350 полос, т. е. 250-350 нуклеотидных последовательностей.

5) Генно-инженерные технологии совокупность методов и технологий получения рекомбинантной днк, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в др организмы.

Основные методы инженерии были разработаны в 70-х годах и вкл 3 осн. метода:

· Получение ген материала (выделение генов или их синтез)

· Включение этих генов в векторную молекулу и создание рек. молекулы днк

· Введение векторной молекулы в геном клетки – реципиента, где она встраивается в хромосомный аппарат. Экспериментальный перенос в др геном, называется трансгенозом.

Клонированные гены человеческого инсулина были введены с плазмой в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, которые природные микробные штаммы никогда не синтезировали. Начато производство генно-инженерного инсулина.

До стадии пр-ва доведены рек интерферон, интерлейкин, эритропоэтин. Активно ведутся работы по разработке вакцин для профилактики и лечения гепатитов, спида и др заб, а также конъюгированных вакцин нового поколения против соцзнач инф.

6) Трансгенные организмы – организмы, в которые вносятся чужеродные гены. Задачи, которые ставят при внедрении генов в др организм:

· Создание активных рек днк, способных к переносу в др организмы.

Рек. днк – это целостная структура, состоящая из молекулы (гена) днк, выбранная по опр свойсвам и молекулы днк обладающие способностью проникать в др организмы.

· Разработка методов переноса рек днк в подходящую клетку

· Создание условий для функционирования отобранного, введенного в клетку.

Генно-инж тех процесс состоит из след этапов:

· Выделение необходимого гена. Он м/б выделен из генома организма или иск. синтезироапн на мРНК с помощью фермента обратной транскриптазы

· Выбор переносчика гена-вектора

· Обработка клонируемого гена вектора одинаковыми рестриктазами

· Сшивание вектора и встроенного в него гена с помощью фермента днк-лигазы с обррек. днк

· Подбор клетки – реципиента, в кот переносится рек. днк

· Введение рек. днк в реципиента

· Обеспечение оптимальных условий для роста и размножения клеток реципиента

· Выделение в чистом виде продукта клонированного гена (белка)

7) Клонирование

Молекулярное клонирование – клонирование молекул днк – наработка большого количества идентичных днк-молекул с исп живых орг-в

Копирование многокл организмов бывает полным (репродуктивное) и частичным. При полном воссоздается весь организм целиком, при частичном – ткани, органы.

Терапевтическое клонирование – клеточная терапия в медицине.

Клонирование днк метод получения и идентификации днк фрагментов и получение их в неограниченном количествею они м/б исп для приготовления днк зондов, создпния библиотек генов.

Библиотека генов – полный набор клонированных днк-фрагментов (клонотека) полученных путем разрезания исходной молекулы днк

Карта генома – схема, определяющая хромосомную принадлежность и расположение генов и др компонентов генома.

Цитогенетические карты хромосом - получают методом диф окрашивания в микроскопе – поперечно-исчерченные

Позиционное картирование – картирование генов различных наследственных заболеваний с неизвестным биохим дефектом. Он основан на анализе сцепления между геном заб и геном днк маркера

8) Использование стволовых клеток в медицине

Генно-инженерные технологии. Трансгенныеорганиз Однако генная инженерия как технология рекДНК возникла в 1972 г., когда в лаборатории П. Берга (Станфордский ун-т, США) была получена первая рекомбинантная (гибридная) ДНК (рекДНК), в которой были соединены фрагменты ДНК фага лямбда и кишечной палочки с кольцевой ДНК обезьяньего вируса SV40. Задачи генной инженерии Основные направления генетической модификации организмов: – придание устойчивости к ядохимикатам (например, к определенным гербицидам); – придание устойчивости к вредителям и болезням (например, Bt-модификация); – повышение продуктивности (например, быстрый рост трансгенного лосося); – придание особых качеств (например, изменение химического состава). Методы генной инженерии Методы генной инженерии основаны на получении фрагментов исходной ДНК и их модификации. Для получения исходных фрагментов ДНК разных организмов используется несколько способов: – Получение фрагментов ДНК из природного материала путем разрезания исходной ДНК с помощью специфических нуклеаз (рестриктаз). – Прямой химический синтез ДНК, например, для создания зондов. – Синтез комплементарной ДНК (кДНК) на матрице мРНК с использованием фермента обратной транскриптазы (ревертазы). Выделенные участки ДНК встраивают в векторы переноса ДНК. Векторы ДНК – это небольшие молекулы ДНК, способные проникать в другие клетки и реплицироваться в них. В состав вектора ДНК входит не менее трех групп генов: 1. Целевые гены, которые интересуют экспериментатора. 2. Гены, отвечающие за репликацию вектора, его интеграцию в ДНК клетки-хозяина и экспрессию требуемых генов. 3. Гены-маркеры (селективные, репортерные гены), по деятельности которых можно судить об успешности трансформации (например, гены устойчивости к антибиотикам или гены, отвечающие за синтез белков, светящихся в ультрафиолетовом свете). Для внедрения векторов в прокариотические или эукариотические клетки используют различные способы, например: 1. Биотрансформация. Используются векторы, способные сами проникать в клетки. Частным случаем биотрансформации является агробактериальная трансформация. 2. Микроинъекции. Используются, если клетки, подлежащие трансформации, достаточно крупные (например, икринки, пыльцевые трубки). 3. Биобаллистика (биолистика). Векторы «вбивают» в клетки с помощью специальных «пушек». 4. Комбинированные методы, например, сочетание агробактериальной трансформации и биолистики. В качестве векторов часто используют плазмиды (кольцевые молекулы ДНК прокариотических клеток), а также ДНК вирусов. У эукариот в качестве векторов используют мобильные генетические элементы – участки хромосом, способные образовывать множество копий и встраиваться в другие хромосомы. В составе одного вектора можно комбинировать различные фрагменты ДНК (различные гены). Вновь образованные фрагменты ДНК называют рекомбинантными. Векторы переноса ДНК вместе с внедренными фрагментами ДНК различными способами вводят в прокариотические или эукариотические клетки и получают трансгенные клетки. В ходе размножения трансгенных клеток происходит клонирование требуемых фрагментов ДНК, в частности, отдельных генов. Клонированные гены эукариот подвергают различным модификациям (например, добавляют перед ними определенные промоторы) и внедряют в клетки-продуценты. Основная проблема состоит в том, чтобы чужеродные гены экспрессировались постоянно, то есть должен происходить синтез необходимых веществ без ущерба для клетки–хозяина. Практические достижения современной генной инженерии заключаются в следующем: – Созданы банки генов, или клонотеки, представляющие собой коллекции клонов бактерий. Каждый из этих клонов содержит фрагменты ДНК определенного организма (дрозофилы, человека и других). – На основе трансформированных штаммов вирусов, бактерий и дрожжей осуществляется промышленное производство инсулина, интерферона, гормональных препаратов. На стадии испытаний находится производство белков, позволяющих сохранить свертываемость крови при гемофилии, и других лекарственных препаратов. – Созданы трансгенные высшие организмы (многие растения, некоторые рыбы и млекопитающие) в клетках которых успешно функционируют гены совершенно других организмов. Широко известны генетически защищенные генно-модифицированные растения (ГМР), устойчивые к высоких дозам определенных гербицидов, а также Bt-модифицированные растения, устойчивые к вредителям. Среди трансгенных растений лидирующие позиции занимают: соя, кукуруза, хлопок, рапс. КЛОНИРОВАНИЕ, воспроизведение генетически однородных организмов (клеток) путём бесполого (вегетативного) размножения. При клонировании исходный организм (или клетка) служит родоначальником клона – ряда организмов (клеток), повторяющих из поколения в поколение и генотип, и все признаки родоначальника. Таким образом, сущность клонирования заключается в повторении одной и той же генетической информации. В основе точного копирования генетического материала (и организма в целом) у эукариотических клеток лежит митоз (у бактерий – простое деление). В многоклеточном организме, зародившемся в результате полового процесса, все клетки, несмотря на их различия и специализацию, представляют собой клон, развившийся из оплодотворённой яйцеклетки. Однако такой организм-клон и генетически, и своими признаками будет отличаться от родительских организмов. Благодаря бесполому (вегетативному) размножению многоклеточный организм может развиться из одной соматической (неполовой) клетки, из группы таких клеток или из части родительского организма. В природе такое размножение, или клонирование, широко распространено у грибов, водорослей, простейших, а также у многих высших растений. У многоклеточных животных клонирование возможно либо в форме почкования, либо как деление тела животного на части и восстановление каждой части до целого организма. Так могут размножаться кишечнополостные, губки, многие черви, мшанки, а из хордовых – оболочники. Классический, издавна известный пример животного, которое, будучи разделено на десятки и даже сотни частей, способно к воссозданию (регенерации) из каждой части целого организма – гидра. Естественное клонирование позвоночных животных встречается редко и возможно, по-видимому, только на ранних стадиях зародышевого развития. Так, однояйцевые близнецы у животных и человека происходят от одной оплодотворённой яйцеклетки в результате её митотиче-ского разделения, т. е. клонирования. Подобное клонирование характерно для броненосцев, у которых обычны однояйцевые двойники. Искусственное, т. е. осуществляемое человеком, клонирование широко применяется как в научных, так и в практических целях. Наряду с различными способами вегетативного размножения, известными с древности, в растениеводстве всё шире входит в практику т. н. микрораз-множение – выращивание посадочного материала из одиночных клеток с применением методов культуры клеток и тканей. Клонирование бактерий и соматических клеток растений и животных используется в микробиологии, в генетике, в практических направлениях биотехнологии и клеточной инженерии, во всех тех теоретических и практических работах, когда необходимо иметь генетически однородный материал. Особый интерес вызывают эксперименты, связанные с клонированием позвоночных животных и человека. Исследования в этом направлении ведутся давно. В 1987 г. отечественные учёные в Пущинском научном центре осуществили первое клонирование млекопитающего – мыши. Для этого из яйцеклетки мыши удаляли ядро, а затем вводили в яйцеклетку ядро из эмбриональной мышиной клетки. Т. е. был использован генетический материал соматической, но недифференцированной (неспециализированной) эмбриональной клетки. В 1997 г. шотланд-ским учёным удалось клонировать овцу, используя в качестве донора генетического материала эпителиальные клетки молочной железы. Зародыш вводили (имплантировали) в организм приёмной матери, которая и вынашивала ягнёнка. В этом случае, что представляет принципиальный интерес, использовалась в качестве донора специализированная соматическая клетка. Таким образом, эти эксперименты доказали, что можно получать генетически идентичные копии (клоны) млекопитающих, используя их соматические клетки. Предполагается, что клонирование найдёт широкое применение в животноводстве. В принципе не представляется невероятным выращивание из хорошо сохранившихся в вечной мерзлоте соматических клеток вымерших животных (напр., мамонта) полноценного организма. Эксперименты по клонированию человека осуждаются международными организациями и запрещены в ряде стран как неприемлемые в нравственном отношении. Тем не менее в кон. 2002 г. в мире появились неподтвержденные сообщения о рождении детей, клонированных из соматических клеток. В генной инженери и клонирование – получение копий определённых участков ДНК (генов). 9) Использование стволовых клеток для лечения некоторых заболеваний — это некий новый рубеж в медицине. Оно делает более реальной надежду на излечение ряда заболеваний, которые казались неизлечимыми до вчерашнего дня. Научно-исследовательские институты, проводящие исследования в этой области сосредотачивают все свои усилия на изучении свойств и лечебного потенциала стволовых клеток. Наиболее примечательно, что стволовые клетки могут развиться и трансформироваться в различные типы клеток в организме на начальном этапе своего развития. Кроме того, во многих тканях они служат своего рода внутренней системой ремонта, так как они могут делиться и формироваться в неограниченном количестве, чтобы пополнить другие клетки, пока человек или животное живы. В то время, как стволовые клетки делятся, каждая новая образующаяся в результате деления клетка имеет потенциал либо оставаться стволовой клеткой или превратиться в другой тип клеток с более специализированной функцией, например, мышечные клетки, эритроциты, или клетки головного мозга. Таким образом, стволовые клетки являются теми клетками, которые еще не «специализированы», то есть, они еще не дифференцированы для конкретной конечной функции. Это особенность делает их чрезвычайно ценными, так как они потенциально могут осуществлять «ремонт» поврежденных органов и тканей. Стволовые клетки представляют собой класс недифференцированных клеток, которые способны дифференцироваться в специализированные типы клеток. Как правило, стволовые клетки поступают из двух основных источников: · Эмбрионы, сформированные на стадии бластоцист фазы эмбрионального развития (эмбриональные стволовые клетки) · Взрослые ткани (взрослые стволовые клетки). Оба типа, как правило, характеризуются своим потенциалом дифференцироваться в различные типы клеток (например, кожи, мышц, кости и т. д. ). Эмбриональными стволовыми клетками являются те, которые формируются на ранней стадии эмбриона, во время первой недели развития. Они называются «тотипотентными«, потому что они могут дифференцироваться во все типы клеток нашего тела. Тем не менее, их использование вызывает серьезные вопросы биоэтики, поскольку их добыча влечет за собой разрушение эмбриона. Пуповинные стволовые клетки НЕ ПРИНАДЛЕЖАТ к этой группе, но являются стволовыми клетками взрослого типа. Как следствие, их терапевтическое применение не вызывает никаких проблем с какой бы то ни было этической точки зрения. Взрослые стволовые клетки присутствуют в некоторых наших органах и тканях, и они, как правило, предназначены для регенерации органа или ткани, с которыми они находятся поблизости. В зависимости от их характеристик, «взрослые» стволовые клетки могут быть плюри— (или мульти-) потентными, то есть, они могут дифференцироваться в некоторые типы клеток, или унипотентных, то есть они могут формировать только один тип клеток. Возможно, самым важным потенциальным применением стволовых клеток человека является размножение и формирование клеток и тканей, которые могут быть использованы для клеточной терапии. Сегодня, пожертвованные органы и ткани часто используются для замены больной или разрушенной ткани, но потребность в трансплантации органов и тканей, значительно превышает имеющиеся запасы. Стволовые клетки, способные дифференцироваться в специфические типы клеток, дают возможность возобновляемого источника запасных клеток и тканей для лечения различных заболеваний, подразумевая также макулярную дегенерацию сетчатки глаза, повреждения спинного мозга, инсульт, ожоги, болезни сердца, диабет, остеоартрит и ревматоидный артрит. В последнее десятилетие жировые ткани человека были идентифицированы как источник мультипотентных стволовых клеток. Полученные из жировой ткани стволовые клетки (ASCs) характеризуются иммуносупрессивными свойствами и низкой иммуногенностью. Стволовые клетки, выделенные из жировой ткани в изобилии, легко извлекаются с помощью липоаспирации, и они способны дифференцироваться в разнообразные типы клеток. В самом деле, стволовые клетки из жировой ткани признаны равноценными, если даже не превосходящими стволовые клетки костного мозга с точки зрения уровня дифференциации клеток (созревания), ангиогенеза (новый роста сосудов) и противовоспалительного действия. По этим причинам, полученные из жировой ткани стволовые клетки являются наиболее многообещающими в области регенеративной медицины. Большое количество полученных из жировой ткани стволовых клеток может быть собрано по ходу одной процедуры, без необходимости дополнительного культивирования клеток. Липосакция для получения жировой ткани — это менее агрессивная процедура, чем метод аспирации костного мозга. В общей сложности можно утверждать, что этот метод является менее инвазивным для пациента и не представляет собой патологических последствий. Небольшое количество жировой ткани (от 100 до 200 мл) может быть легко получено при простой местной анестезии. Кроме того, только один грамм этой ткани содержит примерно 5000 стволовых клеток, называемых стволовыми клетками жировой ткани (ASC) – это примерно в 500 раз больше, по сравнению с тем же объемом костного мозга. По этим причинам, жировая ткань может рассматриваться, как богатый источник мезенхимальных стволовых клеток. Скорость, с которой развиваются исследования стволовых клеток, затрудняет установление четких границ между тем, что уже реально и предлагается в виде конкретной возможности лечения или, что весьма вероятно, станет возможным в ближайшем будущем. Тем не менее, биомедицинские исследования фокусируются на использовании стволовых клеток в качестве инструмента для регенерации многих тканей или органов. На сегодняшний день многие исследования дали обнадеживающие результаты для будущего применения стволовых клеток в лечении многих патологий, таких как: · Кардиоваскулярные заболевания (инфаркт миокарда, ишемическая патология и т. д. ) · Желудочно-кишечные (болезнь Крона). · Почечная (острая почечная недостаточность, пересадка почек и т. д. ). · Печени (цирроз, семейная гиперхолестеринемия). · Легочные заболевания (ХОБЛ). · Нервные расстройства (нейробластома MS, болезнь Паркинсона БАС, приступы и т. д. ) · Поджелудочные патологии (диабет типа 1 и 2). · Кожные (сахарный диабет, системный склероз) · Системная (синдром Шегрена, волчанка, РТПХ (GvHD) · Кости / хрящевые ткани (переломы костей, несовершенный остеогенез, хрящевые дефекты и т. д. ) После процедуры липосакции, жировая ткань собирается в транспортной резервуар и отправляется в лабораторию специальным курьером. Все клетки могут быть подвержены криоконсервации и храниться в клеточном банке для возможного использования в будущем. Стволовые клетки из жировой ткани также используются в косметических процедурах. В течение 24 часов из образца собранной жировой ткани, в условиях абсолютной стерильности, отбираются и идентифицируются мезенхимальные стволовые клетки; затем клетки могут быть отправлены в косметический хирургический центр для немедленного введения. 10) Электронные базы данных Есть 2 группы БД: · ДЛЯ ВРАЧЕЙНЕ ген специальностей – для уточнения диагнстикинаслед заб. БД п/с каталоги содерж инфу по симптоматике и диагностике наслд заб. В комп вводятся симптомы предполагаемой насл болезни т осущ комп поиск наиболее вероятного диагноза. Далее по выюранному диагнозу врач обращ в бд и получает описание синдрома и фото типичных больных. Существуют несколько каталогов и бд содерж инфу о насл болезнях – генных, хромосомных: Менделирующаянаслчел-ка. Автор маккюзин ОМИМ – информационная поисковая система содерж 11000 симптомов. Каталог разделен на след разделы: Молекулярные деффекты (мутации) при менделевских нарушениях Краткий обзор ген-х карт чел-ка Раздел аутосомно-доминантных и аутосомно-рецессивных генов Раздел Х хромосомных, У хромосомных, метохондриальных генов Каждый менделирующий признак имеет в каталоге 6значный номер. н/р, омим 100800, фенилкетонурияомим 216600 Оксфордская мед бд – содеожит генные нарушвызв средовыми факторами СИНГЕН – ИНФ КАТАЛОГ вкл 2000 симпврожд пороков развития ХРОДИС – хромосомные дисморфии – поисковая система по хромосомным болезням ч-ка, вкл 2000 больных с хромом болезнями МЕТГЕН содержит более 4000 насл болезней Вторая группа БД рассчитана на спец генетиков 11)Понятие биоинформатики. Биоинформатика (БИ) или вычислительная биология (ВБ) одна из разделов биологии, которая рассматривает возможности исп-я комп-в для реш-я биол-х задач. Термины БИи ВБ часто понимаются как одинаковые, хотя один указывает на разработку алгоритмов, другой – конкретные вычислительные методы. Основные задачи: Изучение геномов человека и др организмов – геномика Анализ и представление структуры белков – протеомика Анализ взаимодействия белков друг с другом и с др молекулами Моделирование эволюции. Основные области исследования: А) анализ ген исслед берет начало в 1977 когда был секвенирован ген фага х174. Впервые эти данные были занесены в БД. Так появ БД по математ анализу данных. Б) обработка большлго количества данных получаемых в послед при секвенировании данных одна одна из главных задач БИ В) вопросы аннотации геномики – процесс маркировкм генов и др объектов в последоват днк С) вычислительно эволюционная биология – исслпроисх и появл новых видов. Современное состояние в сфере БИ БИ преимущественно развивается в сша, странах европы и постепенно в россии. 12)Проблемы БИ: А)среди биотехнологических проектов важнейшим яв-ся работа с чел-ким геномом Б) в медицине набирает оборотыген-е редактирование – леч-е наслд заб с помощью удаления или замены «неправильгых» генов В)персонализированная геномика – «персональная, личностная» кот позволит поставить пациенту диагноз, подобрать правильное лечение и создавать препараты для индивида, по результатам исследования генотипа С)активно развивается направление генетики диагн раковых опухолей, анализ днк клеток опухолей, нужно подобрать лечение, кот с наибольшей вероятностью позволит излечить заболевание, а также прогнозировать егопоявление.