определения специфической активности иммунопероксидазного коньюгата в прямом ИФА

Методика № 7.2

определения специфической активности иммунопероксидазного коньюгата в прямом ИФА

(гетерогенный ИФА I типа с иммобилизованными антителами и меченными ПХ антигенами)

День первый.

1. Согласно методике приготовления образцов (см. Методика4) приготовить растворы антител по 2500 мкл в cтеклянных пробирках на 5 мл в 0,05 М Na-бикарбонатном буфере, рН 9,5,с концентрацией, которая определяеся в шахматном титровании.

2. В предварительно подготовленный планшет в лунки при помощи одноканальной автоматической пипетки на 200 мкл разлить растворы, приготовленный в п.1 по 200 мкл в лунки, согласно схеме1:

Схема1

кнс

АТ сп

АТ несп1

АТ несп2

АТ несп3

АТ несп4

4. Для контроля уровня неспецифической сорбции (кнс) в 12-й стрип снести по 200 мкл раствора неидентичного негомологичного белка в концентрации 10 мкг /мл в 0,05 М Na-бикарбонатном буфере, рН 9,5.

5. Все незанятые лунки заполнить физ. раствором по 200 мкл.

6. Планшет закрыть крышкой и поставить инкубироваться в холодильник при температуре 4+2 ⁰С на ночь (16-18 часов)

День второй.

1. Приготовить отмывочный раствор согласно методике приготовления (см. Методика2 растворы)

2. Планшет с раствором вынуть из холодильника,

3. Слить из планшета раствор (стряхивая его в раковину) и подсушить, постукивая по фильтровальной бумаге.

4. При помощи восьмиканальной пипетки недозированно (объем должен быть не менее 200 мкл/лунку) внести отмывочный раствор во все лунки. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Раствор слить (стряхивая его в раковину) и подсушить, постукивая по фильтровальной бумаге.

5. Операцию, изложенную в п.3-4 повторить еще 2 раза. Крышку протереть досуха и накрыть планшет. В таком состоянии его можно хранить не более 30 мин.

6. Провести блокировку оставшихся свободными центров связывания. Приготовить 6 мл раствора кнс с концентрацией 1 мг/мл в 0,05 М Na-бикарбонатном буфере, рН 9,5, разлить по 200 мкл в лунки, где иммобилизованы белки, кроме лунок где иммобилизован кнс. Закрыть крышкой и поставить в термостат на 2 часа при 37 ⁰С.

7. По истечении времени инкубации планшет отмыть как указано в п.3-5.

8. Приготовить раствор иммунопероксидазного коньюгата в отмывочном растворе в разведении 10 объемом 4400 мкл в пробирке объемом 5 мл: к 3960 мкл отмывочного раствора прилить 440 мкл концентрата коньюгата, перемешать стеклянной палочкой. Разлить согласно схеме 2 по 200 мкл во все лунки с иммобилизованным антигеном стрипа В, а также в лунку с иммобилизованным кнс. В пробирке осталось 2200 мкл раствора коньюгата. К ним прилить 2200 мкл отмывочного раствора, перемешать той же стеклянной палочкой, предварительно промытой дистиллированной водой и подсушенной фильтровальной бумагой. Перенести полученное разведение в лунки стрипа С согласно схеме 2 по 200 мкл. В пробирке остается 1400 мкл раствора. Т.о. получится новое разведение с шагом 2 (т.е. разведение 100). Операцию повторять до тех пор, пока не получите окончательное разведение 320. Все оставшиеся лунки заливаются физ.раствором по 200 мкл.

12 Следующая ⇒