Описание технологической схемы

2.3 Описание технологической схемы

В инокулятор 1 поступает штамм микроорганизмов E. Сoli. В стерилизаторе 2 приготавливается и стерилизуется бессывороточная среда на основе RDF (RPM1 1640 (Roswell Park Memorial Institute), DME(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), F12, трансферин, инсулин, селенит натрия, этаноламин, альбумин, вода) при давлении 1 атм, температуре 120-125 оС в течение 20-30 мин. Затем готовая и стерилизованная питательная среда, а также инокулят, содержащий моноклональные антитела, поступают в барботажный ферментатор с перемешиванием 3, где в течение 24 часов при температуре 37оС в присутствии СО2 (примерно 5%) происходит накопление целевого продукта. Для равномерного распределения клеток по всему объему ферментатора необходимо обеспечить постоянное перемешивание суспензии, а также поддерживать аэробные условия процесса путем непрерывной подачи воздуха. Процесс культивирования производится полунепрерывным способом с подпиткой, т.е. питательная среда непрерывно подается в ферментатор, в котором создаются оптимальные условия для роста антител, а из ферментатора также непрерывно вытекает культуральная жидкость вместе с биомассой. При этом существует равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой. Так как целевой продукт находится в культуральной жидкости, то после процесса ферментации содержимое ферментатора подается в центрифугу 4, где разделяются культуральная жидкость и биомасса. После отделения биомассы, культуральная жидкость поступает в фильтр 5, где фильтруется через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. В процессе фильтрации осуществляется полное удаление оставшихся клеток, а также снижение объема жидкости с целью облегчения хроматографии. Отфильтрованная культуральная жидкость временно поступает в емкость для хранения 6. Из емкости для хранения культуральная жидкость поступает в колонну для аффинной хроматографии 7, а затем в колонну для ионообменной хроматографии 8. В результате этих процессов происходит более тщательная очистка культуральной жидкости. В качестве ионообменника чаще всего используют диэтиламиноэтил, прикрепленный к целлюлозе, сефарозе или акриламидным гранулам. В аффинной хроматографии - прикрепленные к носителю антигены. Аффинным носителем (сефароза или силикагель) заполняются колонки различного диаметра (от нескольких миллиметров до метра) и через эти колонки пропускают раствор, содержащий исследуемое антитело. Большинство макромолекул проходит через частицы носителя не задерживаясь, в то время как между антигенами, иммобилизованными на носителе, и антителами, содержащимися в растворе, образуется иммунный комплекс. После отмывки носителя от не связавшихся антител иммунный комплекс разрушают, пропуская через носитель растворы с низкими (pH 2,0 — pH 4,0) или высокими (pH 11,0 — pH 12,0) значениями рН, либо растворы с высокой ионной силой (2М NaCl), либо растворы, содержащие хаотропные соединения (KSCN). При этом исследуемые антитела элюируют с носителя, собирают и переводят в оптимальный для их хранения буфер.

Далее очищенная культуральная жидкость поступает в установку вирусной инактивации 9 с целью обеззараживания вирусов и бактерий. Следующий этап производства имеет своей целью удаление оставшихся примесей и повышение объемной концентрации целевого продукта. Для этого применяется колонка для гель-фильтрации 10 с агарозой, сефарозой или сефадексом, после чего продукт поступает в емкость 11.