Определение оптимального разведения иммунопероксидазного конъюгата в прямой схеме иммуноферментного анализа.

Методика № 9.

День первый.

1. Согласно методике приготовления образцов (см. Методика 4) приготовить раствор антигена в 0,05 М Na-бикарбонатном буфере, рН 9,5,с концентрацией 2,5 мкг/мл, объемом 13 мл.

2. В предварительно подготовленный планшет во все лунки (кроме крайних) при помощи одноканальной автоматической пипетки на 200 мкл разлить раствор, приготовленный в п.1, по 200 мкл.

3. Все незанятые лунки заполнить физ. раствором по 200 мкл.

4. Планшет закрыть крышкой и поставить инкубироваться в холодильник при температуре 4+2⁰С на ночь (16-18 часов)

День второй.

1. Приготовить отмывочный раствор согласно методике приготовления (см. Методика 2 растворы)

2. Планшет с раствором вынуть из холодильника,

3. Слить из планшета раствор (стряхивая его в раковину) и подсушить, постукивая по фильтровальной бумаге.

4. При помощи восьмиканальной пипетки недозированно (объем должен быть не менее 200 мкл/лунку) внести отмывочный раствор во все лунки. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Раствор слить (стряхивая его в раковину) и подсушить, постукивая по фильтровальной бумаге.

5. Операцию, изложенную в п.3-4 повторить еще 2 раза. Крышку протереть досуха и накрыть планшет. В таком состоянии его можно хранить не более 30 мин.

6. Приготовить раствор коньюгата в отмывочном растворе в начальном разведении в 50, 200 и 500 раз. Путем разведения исходного раствора отмывочным раствором приготовить следующие разведения иммунопероксидазного конъюгата (схема 1). В лунки внести по 200 мкл. Все оставшиеся лунки заливаются физ.раствором по 200 мкл.

Схема 1.

7. Закрыть сухой крышкой и поставить в термостат на 1 час при 37 ⁰С.

8. По истечении времени инкубации планшет отмыть как указано в п.3-5.

9. Включить вертикальный фотометр и подготовить его к работе согласно инструкции (см. Инструкция 5 фотометр).

10. Приготовить субстратный раствор объемом 20 мл согласно методике приготовления (см. Методика 2 растворы). После этого во все лунки, куда заливался коньюгат, внести по 200 мкл субстратного раствора. Планшет закрыть крышкой и поставить в темноту при комнатной температуре на 12 мин.

11. По истечении времени инкубации во все лунки (кроме крайних) внести при помощи восьмиканальной пипетки по 25 мкл 10%-ой серной кислоты

12. Для контроля работы вертикального фотометра в 1-й стрип внести по 200 мкл контрольные растворы (раствор бихромата калия) согласно схеме 2, где К– раствор, дающий оптическую плотность при 490 нм приблизительно 1,4. Значение оптической плотности К может меняться, смотри его на флаконе с приготовленным раствором.

13. По истечении времени инкубации провести измерение оптической плотности на вертикальном фотометре согласно инструкции (см. Инструкция 5 фотометр)

14.После проведения измерений фотометр выключить, содержимое планшета стряхнуть в раковину, а планшет выбросить. Повторно использовать данный планшет для целей и задач ИФА нельзя.

Оценка результатов: заполняется шаблон и строится градуировочная зависимость ОП от концентрации иммунопероксидазного конъюгата.