Микроклональное размножение

Такие центральные общебиологические проблемы как дифференцировка, канцерогенез, клеточная подвижность, пролиферация, передача наследственной информации, регуляция экспрессии генов и другие решаются, в основном, на клеточных культурах.

Клеточные культуры имеют также большое значение для решения прикладных задач медицины, сельского хозяйства, биотехнологии и биологической промышленности. К основным задачам следует отнести массовое промышленное производство вакцин и физиологически активных соединений, получение моноклональных антител методами гибридомной технологии, лечение тяжелых заболеваний методами генотерапии и клеточной заместительной терапии, повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и выведение новых сортов растений, сохранение биоразнообразия генофонда путем криоконсервации соматических и половых клеток животных и растений.

Клетки в культуре подвержены высокой наследственной изменчивости при длительном культивировании под действием меняющихся условий внешней среды. Успешное сохранение исходных или направленно измененных свойств клеточных линий достигается путем соблюдения строго выдерживаемых условий культивирования и криоконсервации клеточных культур.

Поддержание исходных клеточных свойств и контроль за их состоянием осуществляют Национальные коллекции разных стран.

Микроклональное размножение

Применение:

При невозможности или затрудненности размножать семенами;

Для ускоренного размножения, в том числе трудно размножаемых видов.

Этапы микроклонального размножения:

выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры;

собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов;

укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+ 2°, + 10 °C);

выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Основной метод, используемый при клональном микроразмножении растений — это активация развития уже существующих в растении меристем основывающийся на снятии апикального доминирования. Это может быть достигнуто двумя путями:а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде;б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентениладенин и зеатин. Полученные таким образом побеги отделяют от первичного материнского экспланта и вновь культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.

Второй метод — это индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и, таким образом, регенерировать целые растения. Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если их удается получить свободными от инфекции. Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10:1 или 100:1 в качестве ауксина в этом случае наиболее часто используют бета-индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) или альфа-нафтилуксусную кислоту (НУК). Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений, которым были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинт, гладиолусы, тюльпаны) из луковичных чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представители рода Brassica (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокколи — из сегментов гипокотиля, семядолей, листьев; лук, чеснок — из верхушечной меристемы, ткани донца луковиц; томаты — из апикальных или пазушных меристем; салат цикорный — из сегментов листовых пластинок; петуния — из сегментов корней; глоксиния, фиалки— из сегментов листовых пластинок, а также некоторые представители древесных растений — из изолированных зрелых и незрелых зародышей.