Интерпретация диагностических тестов SARS-CoV-2

Обзор

6 мая 2020

Интерпретация диагностических тестов SARS-CoV-2

Nandini Sethuraman, MD¹; Sundararaj Stanleyraj Jeremiah, MD²; Akihide Ryo, MD, PhD²

Пандемия Новой коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19) продолжает поражать бóльшую часть мира. Осведомлённость о диагностических тестах для выявления её вобудителя (коронавирус SARS-CoV-2) все еще повышается, и важны четкое понимание cпецифики тестов и интерпретация их результатов. В настоящем обзоре рассмотрены особенности интерпретации двух типов диагностических тестов, обычно используемых для инфекции, вызванной SARS-CoV-2 – ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и IgM, IgG иммуноферментный анализ (ИФА/ELISA) – и возможную динамику изменения результатов с течением времени (см. рисунок).

Рисунок: Предположительная динамика изменения диагностических тестов для выявления инфекции SARS-CoV-2 относительно проявления симптомов.

Предполагаемые временные интервалы и показатели выявления вирусов основаны на данных нескольких опубликованных отчетов. Из-за различий в значениях между исследованиями предполагаемые временные интервалы следует рассматривать как приблизительные, а вероятность обнаружения инфекции SARS-CoV-2 представлена качественно (не количественно).

^a Обнаружение происходит только в том случае, если пациенты находятся под активным наблюдением с момента инфицирования.

^b Более вероятно зарегистрировать отрицательный, чем положительный результат с помощью ПЦР-диагностики мазка из носоглотки.

Обнаружение вирусной РНК методом ПЦР с обратной транскрипцией

До настоящего времени наиболее часто используемым и надежным тестом для диагностики COVID-19 был тест ОТ-ПЦР, проводимый с использованием мазков из носоглотки или других биоматериалов из верхних дыхательных путей, включая мазок из горла или слюну. Различные РНК-мишени используются разными производителями, при этом большинство тестов нацелено на один или более генов оболочки (env), нуклеокапсида (N), Spike-протеина (S), РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) и ORF1. Чувствительность тестов к отдельным генам сопоставима согласно сравнительным исследованиям, за исключением зонда для праймера RdRp-SARSr (Charité), который имеет немного меньшую чувствительность, вероятно, из-за несоответствия с обратным праймером.¹

У большинства пациентов с выраженными симптомами инфекции COVID-19 вирусная РНК в мазке из носоглотки, измеренная по пороговому значению цикла (Ct), обнаруживается уже в первый день появления симптомов и достигает пика в течение первой недели после появления симптомов. Пороговое значение цикла представляет собой количество циклов репликации, необходимых для получения флуоресцентного сигнала, причем более низкие значения Ct отражают более высокую РНК-вирусную нагрузку. Значение Ct менее 40 клинически рассматривается как ПЦР-положительный результат. Эта «позитивность» значения начинает снижаться к третьей неделе и впоследствии вирусная нагрузка становится неопределяемой. Тем не менее, пороговое значение цикла, полученное у госпитализированных пациентов с тяжёлой формой течения заболевания, ниже значений при лёгком течении, и «позитивность» ПЦР может сохраняться более трёх недель после начала заболевания, когда у большинства пациентов с лёгким течением результат становится отрицательным.² Однако «положительный» результат ПЦР отражает только обнаружение вирусной РНК и не обязательно указывает на наличие жизнеспособного вируса.³

В некоторых случаях вирусная РНК была обнаружена с помощью ОТ-ПЦР даже позже 6-й недели после первого положительного теста. Несколько случаев также были отмечены как положительные после двух последовательных отрицательных тестов ПЦР, проведенных с интервалом в 24 часа. Неясно, является ли это ошибкой тестирования, повторным заражением или повторной активацией репликации. В исследовании 9 пациентов попытки выделить чистую культуру вируса в культуре клеток не увенчались успехом после 8-го дня заболевания, что коррелирует со снижением контагиозности после первой недели.³ Именно поэтому «стратегия на основе симптомов» Центра по контролю и профилактике заболеваемости (CDC) предписывает, что сотрудники здравоохранения могут вернуться к работе, если «прошло не менее 3 дней (72 часа) с момента выздоровления, определяемого как нормализация температуры без применения жаропонижающих препаратов и улучшение респираторной симптоматики (например, кашель, одышка); и с момента появления первых симптомов прошло не менее 10 дней».⁴

Продолжительность «позитивности» ПЦР других образцов биоматериала отличается от мазка из носоглотки. Позитивность ПЦР снижается медленнее в мокроте и может оставаться положительной после отрицательного результата мазка из носоглотки. В одном исследовании позитивность ПЦР в кале наблюдалась у 55 из 96 (57%) инфицированных пациентов и оставалась положительной в кале после мазка из носоглотки в среднем от 4 до 11 дней, но не коррелировала с клинической тяжестью.² Установлено, что сроки выявления методом ПЦР в образцах мокроты и стула была сходной, что было оценено Wölfel и соавторами.³

В исследовании 205 пациентов с подтвержденной новой коронавирусной инфекцией COVID-19 положительные результаты ОТ-ПЦР были самыми высокими в образцах бронхоальвеолярного лаважа (93%), за которыми следовали мокрота (72%), мазок из носа (63%) и мазок из глотки (32%).⁵ Ложноотрицательные результаты были получены в основном из-за несоответствия сроков забора проб и начала заболевания и ошибками техники забора проб, особенно мазков из носоглотки. Специфичность большинства тестов ОТ-ПЦР составляет 100%, поскольку структура праймера специфична для последовательности генома SARS-CoV-2. Случайные ложноположительные результаты могут возникнуть из-за технических ошибок и контаминации реагента.

Обнаружение антител к SARS-CoV-2

Инфекция COVID-19 также может быть обнаружена косвенно путем измерения иммунного ответа хозяина на инфекцию SARS-CoV-2. Серологическая диагностика особенно важна для пациентов с легкой и средней тяжестью течения заболевания, которые могут обратиться поздно, уже по прошествии двух недель от начала заболевания. Серологическая диагностика также становится важным инструментом для оценки распространенности COVID-19 в сообществе и выявления людей, которые являются иммуннизированными и потенциально «защищены» от заражения.

Наиболее чувствительным и самым ранним серологическим маркером являются суммарные антитела, уровни которых начинают повышаться со второй недели появления симптомов.⁶ Несмотря на то, что при проведении ИФА IgM и IgG оказались положительными даже на четвертый день после появления симптомов, наиболее высокие показатели выявляются на второй и третьей неделе болезни.

Например, сероконверсия IgM и IgG произошла у всех пациентов в период между третьей и четвертой неделями клинического проявления заболевания, как было выявлено у 23 пациентов в исследовании To и соавторов.⁷ и у 85 пациентов в исследовании Xiang и соавторов.⁸ После этого IgM начинает снижаться и достигает более низких значений к пятой неделе, и почти исчезает к седьмой неделе, тогда как IgG сохраняется более семи недель.⁹ В исследовании 140 пациентов комбинированная чувствительность ПЦР и ИФА (IgM), направленная на нуклеокапсидный (NC) антиген, составила 98,6% против 51,9% при применении только ПЦР-диагностики. В течение первых 5,5 дней количественная ПЦР имела более высокий уровень позитивности, чем IgM, тогда как ИФА (IgM) имел более высокий уровень позитивности после 5,5 дня болезни.¹⁰

Иммуноферментный анализ IgM и IgG-антител имеет специфичность более 95% для диагностики COVID-19. Тестирование парных образцов сыворотки совместно с начальной ПЦР и повторной (двумя неделями позже) способно еще более повысить точность диагностики. Как правило, большинство антител вырабатывается против наиболее распространенного белка вируса, который является NC. Поэтому тесты, которые обнаруживают антитела к NC, будут наиболее чувствительными. Однако рецептор-связывающий домен белка S (RBD-S) является белком адгезии к клеткам хозяина, соответственно антитела к нему будут более специфичными и, как ожидается, будут нейтрализующими. Следовательно, использование одного или обоих антигенов для выявления IgG и IgM приведет к высокой чувствительности.⁷ Однако антитела могут иметь перекрестную реактивность с SARS-CoV и, возможно, с другими представителями коронавирусов.

Экспресс-тесты для выявления антител в местах оказания медицинской помощи были разработаны, широко доступны и имеют различное качество. Многие производители не раскрывают природу используемых антигенов. Эти тесты носят исключительно качественный характер и могут указывать только на наличие или отсутствие антител против SARS-CoV-2. Присутствие нейтрализующих антител может быть подтверждено только с помощью реакции биологической нейтрализации вируса (PRNT). Однако было показано, что высокие титры антител IgG, обнаруженные при помощи ИФА, имеют прямую корреляцию с нейтрализующими антителами.⁷ Стойкость и продолжительность иммунной защиты, предоставляемой нейтрализующими антителами, остаются неизвестными.

Заключение

На основе имеющихся данных был разработан клинически полезный график диагностических маркеров для выявления COVID-19 (рисунок). Большинство доступных данных относятся к взрослому населению без признаков иммунодефицита. Динамика ПЦР-«позитивности» и сероконверсии может варьироваться у детей и других групп, включая большую популяцию бессимптомных носителей без установленного диагноза и активного наблюдения. Остается много спорных вопросов, в частности, как долго длится потенциальный иммунитет у инфицированных SARS-CoV-2, как у бессимптомных носителей, так и у больных с клиническими проявлениями.

Информация о статье:

Автор, ответственный за переписку: Sundararaj Stanleyraj Jeremiah, д.м.н., факультет микробиологии и исследований молекулярной биозащиты, Медицинский факультет Йокогамского городского университета, 3-9 Фукуура, Канадзава-ку, Иокогама 236-0004, Япония (rediffjerry@gmail.com).

Опубликовано он-лайн: May 6, 2020. doi:10.1001/jama.2020.8259

12 Следующая ⇒