Г.В. Томчук, Л.А. Рязанова. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ В ГЕРОНТОЛОГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ДРОЗОФИЛЕ. Текст доклада

УДК

Г.В. Томчук, Л.А. Рязанова

ФГБОУ ВО «ЮУрГГПУ», г. Челябинск, Россия

tttooommmccchhhuk@gmail.com; ryazanovala@cspu.ru

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ В ГЕРОНТОЛОГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ДРОЗОФИЛЕ

Текст доклада

Слайд №2

По одному из наиболее простых и понятных определений, экология − это наука, изучающая взаимодействия организма с факторами среды. В данной публикации, через экологическую призму, рассмотрено исследование ПЖ дрозофил. Приведены примеры из собственных экспериментов (первый опыт с 9.08.2019 по 25.10.2019, второй, начавшийся 28.01.2020, уже находится в стадии завершения), высказаны предположения по возможности использования подобных работ в школе.

Слайд №3

Основным параметром объекта исследования, который мы отслеживаем, является ПЖ мушек (предмет исследования). ПЖ зависит от огромного количества факторов, часть из них типичные средовые факторы. Другая часть имеет эндогенную природу: факторы внутренней среды организма. К последним и наиболее фундаментальным относится генотип организма со всеми вытекающими особенностями метаболизма и параметаболизма. По мнению А.Г. Голубева, создателя параметаболической теории старения (ПТС), именно параметаболизм выступает фундаментальной причиной старения, а оно есть возрастающая с увеличением ПЖ особи вероятность смерти. Собственно ради открытия нюансов процесса старения и изучается ПЖ различных биосистем. В своей работе, для интерпретации данных, мы пользуемся логикой именно ПТС. ПТС подробно описывает эндогенные факторы влияющие на ПЖ, экзогенные условия в ней так же учитываются - параметр С(t) в формуле обобщенного закона Гомпертца-Мейкхема. Геронтологические исследования стремятся снизить влияния средовых факторов (член Мейкхема), для создания условий приближенных к идеальным, в которых смерть (достижение максимальной для особи величины ПЖ) обусловлена, по большей части, скоростью старения.

Слайд №4

Но так ли легко избавиться от фона условий среды в эксперименте, где мухи содержаться в стеклянных пробирках объёмом 32 мл, диаметром 25мм и высотой в 7,5 см? Обсудим те экологические факторы, которым, на наш взгляд, делегирована (пусть и неумышленно) часть функций по созданию акта гибели организма.

Слайд №5

Начнём с группы тривиальных факторов, которые обеспечивают чистоту помещения, где содержаться мушки. Это уборка помещения, мытьё и прокаливание пробирок (1 час в термостате при 110), мытьё рук с мылом перед различными манипуляциями в лаборатории, чистота ваты, которой закрываются пробирки, доведение до кипения среды перед разливом … Вышеназванные условия косвенно влияют на ПЖ дрозофил за счёт увеличения/уменьшения шансов образования плесени на питательной среде в пробирках.

Слайд №6

Особо хочется выделить фактор, который обладает не только косвенным влиянием, как предыдущие, но и характеризуется прямыми воздействиями следующих типов: сотрясения мух при пересадке, придавливания ватой при закрытии пробирок. Пересадка особей из одной пробирки (со старой средой) в другую (с новой питательной средой) помимо прочего обусловливает наличие цензурированных данных (мушки могут вылететь или быть раздавлены).

Сама техника пересадки и степень владения исследователя ею играют важную роль и сказываются на уровне выраженности отрицательных моментов пересадок (а их будет порядка 20-ти). Планируя подобные работы с учащимися школ, необходимо заложить пробный опыт, для освоения техники пересадки. Также нами замечено, что самок и самцов дикого типа и самок линии white пересаживать сложнее, чем самок линий ebony и vestigial. Активность первых выше, чем у ebony, а отсутствие развитых крыльев не даёт шанса вылететь в момент пересадки особям vestigial. Разработка более простого и не требующего навыка способа пересадки упростила бы проведение подобных работ. Возможно, разработки такого рода станут продуктами исследовательских проектов учащихся.

Нами замечено, что в день переноса на новую среду мухи в пробирках показывают незначительный уровень активности, но как только оказываются на новом субстрате, активность их резко увеличивается. Возможно, это связано с уменьшением количества клеток дрожжей на поверхностном слое среды.

Слайд №8

Заявленное подтверждает проведение двух опытов, аналогичных по всем условиям, кроме частоты пересадок (температура была в интервале от 21°С до 26°С) дающее существенную разницу параметров ПЖ самцов линии дикого типа. В первом опыте пересадки осуществлялись в последовательности: одна на 3-й день, четыре пересадки на 5-й день, две на 6-й день, одна на 7-й день, одна на 8-й день, одна на 6-й день, одна на 4й день и одна на 5й день. Всего двенадцать пересадок. Во втором опыте (вторая повторность) все пересадки (на 29.03.20 их было пятнадцать, но эксперимент продолжается, ещё живы особи линии Canton-S, ebony и white, погибли все мушки линии vestigial и самцы дикого типа) осуществляются на четвёртый день. Интересно, что сохраняется структура кривой смертности (своеобразные «ступеньки»). Обработка данных проводилась в статистической программе OASIS 2 (проводя подобные опыты, учащиеся осваивают статистические методы).

Слайд №7

Для функций выживаемости лог-ранг тест показал χ2 = 299 при р<0,001.

Разница в показателях ПЖ самцов дикого типа, на наш взгляд, обусловлена изменением числа пересадок. Интересно, что самцы, которые пересаживались меньше (дольше находились на старой среде), прожили дольше группы второго опыта, которые пересаживались чаще, соответственно были на свежей среде дольше.

Слайд №10

В то же время, данные этих же опытов по vestigial показывают незначительные отличия статистик ПЖ.

Слайд №9

Схожие кривые выживаемости двух повторностей, значение лог-ранг теста для функций выживаемости: χ2 = 0,09 при р=0,7653.

Видно, что до 26 дня выживаемость была выше у группы с более частыми пересадками, но после наоборот. Возможно, это связано с возрастающей с возрастом чувствительностью к пересадкам особей vestigial.

Слайд №11

Как отдельное условие можно выделить состояние поверхности питательной среды. Обычно на 2-й и 3-й дни пребывания мух в пробирках, в некоторых местах среда отходит от стекла, и образуются своеобразные трещины и впадины, которые они активно посещают. Часть из них застревает там, не может выбраться и пополняет банк цензурированных данных.

Слайд №12

В наших экспериментах первым стрессовым фактором абиотической природы является однократное химическое воздействие диэтиловым эфиром на дрозофил с целью их усыпления и дальнейшего разделения по полу, количеству и помещения в пробирки. Важно, чтобы воздействие эфиром было равносильным для всех особей, для этого необходимо не усыплять повторно некоторые группы, а успевать разделить за одно усыпление. Если есть особи, которые не проснулись после эфиризации, то их не нужно учитывать при регистрации погибших. Если наблюдается большая смертность в первые два три дня после эфиризации, то это необходимо учесть при интерпретации результатов, особенно, если есть опыты для сравнения, в которых смертность первые дни была много ниже. В таблице 3 показано количество зафиксированных смертей с 4-го по 19-й день (верхняя строка) у самок Canton-S в первом и втором опытах. В обоих экспериментах 1-й и 2-й дни были днями начала лёта, 3-й − день эфиризации. Большое количество смертей приходится на первые три дня после обработки эфиром (числа в ячейках второй и третьей строки), а далее устанавливается «плато» почти без умерших особей. Логично предположить, что погибают мухи, плохо перенесшие воздействие эфира. Возможно, во втором опыте воздействие оказалось более длительным или было больше мух менее устойчивых к наркотизации. В пользу первой причины свидетельствует привлечение учащихся к проектной деятельности в ходе второй повторности.

Слайд №13

К биотическим факторам, влияющим на ПЖ можно отнести наличие/отсутствие противоположного пола, плотность особей в пробирке и неоплодотворенное состояние самок. Все эти факторы, по-видимому, играли роль в наших опытах, но накопленных данных пока недостаточно для обсуждения.

Слайд №14

Безусловно, самыми значимыми остаются два абиотических фактора: температура и влажность. В нашей лаборатории держать их на строго фиксированном уровне возможности нет, но удаётся поддерживать в определённом интервале (температуру). Влажность количественно не фиксируется. Но в любом случае, в каждом опыте эти два фактора действуют одинаково на все группы (константа условий), а в сравнении повторностей это обстоятельство будет учитываться.

Слайд №15

В ходе экспериментов замечены возраст-зависимые особенности линий. У некоторых самок (конкретное число не фиксировали) линии ebony примерно с 40-ка дневного возраста замечено сильное вздутие брюшка, на подобии водянки (рис.3). Особи с вздутым брюшком не могут высоко подниматься по стенке пробирки (максимум 1,5 см и сразу падают) и почти все прилипают кончиком брюшка либо к среде, либо к стеклу пробирки, теряя при этом возможность к передвижению, и погибают в фиксированном положении. Много меньше случаев вздутия замечено у самок white, однако оно не отмечалось у самок vestigial и мух дикого типа (у самок и самцов).

С 43 дня у некоторых самок white (от 1-й до 3-х особей в пробирке) сразу после пересадки на новую среду фиксируется неподвижное состояние, длящееся приблизительно 15-30 секунд, после состояние нормализуется. У других линий подобное не замечено.

Слайд №16

Экологический взгляд на исследования ПЖ дрозофил помогает увидеть множество нюансов в работе, которая требует поддержания идеализированных условий жизни мух. Он способствует формированию идей постановки опытов (в том числе для проектной, исследовательской деятельности учащихся), благодаря которым можно показать влияние средовых факторов на жизнеспособность двукрылых.

Слайд №17

Геронтологический эксперимент очень сложен, трудоёмок и критичен к временному ресурсу исследователя. Такие эксперименты обладают потенциями для трудового воспитания школьников (мытьё пробирок, фиксация данных и пересадки согласно графику), непредсказуемостью результатов и большим спектром теорий для интерпретации.

Слайд №18