Дисциплина: Микробиология. ЗАНЯТИЕ №12.

Выполнил:

Думилин Г.А.,

206 группа,

лечебный факультет.

Дисциплина: Микробиология

ЗАНЯТИЕ №12.

Темы: Прикладная иммунология:

· Серологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

· Выявление и идентификация специфических антигенов и специфических антител с помощью реакций агглютинации и преципитации, их варианты.

1.Реакции иммунитета: две фазы реакции, характеристика.

Реакции между антигенами и антителами in vitro, или серологические реакции, применяют для выявления неизвестного антигена или антитела с помощью известного антитела или антигена.

Эти реакции протекают независимо от их типа в 2 фазы:

I-фаза-специфическая. Происходит быстрое связывание активного центра антитела с антигеном. Оно обусловленно вандервальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимодействием. Их прочность и количество зависит от аффинности, авидности антител и их валентности.

II-фаза-неспецифическая. Развивается медленно, требует присутствия электролитов и оптимального pH среды. Неспецифическая фазаможет проявляться разнообразными видимыми явлениями: образование хлопьев, приципитации в виде помутнения, растворения клеток и т.д.

Серологические реакции характеризуются: специфичностью и чувствительностью.

Специфичность-это способность антигенов реагировать только с определёнными антителами.

Чувствительность-это минимальное количество антигенов или антител, которое выявляет данная реакция.

2.Реакция агглютинации: участники реакции, их характеристика, методы постановки  реакции, практическое применение реакции агглютинации.

Реакция агглютинации-это склеивание и выпадение в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсорбированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом.

Реакция протекает в 2 фазы:

· В первой фазе происходит специфическая адсорбция антител на поверхности клетки или частицы.

· Во второй фазе происходит образование агрегата (агглютината) и выпадения его в осадок в присутсвии электролита (раствор натрия хлорида).

Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминатной группой другого антитела. Избыток или недостаток антител припятствует проявлению агглютинации.

Для постановки реакции агглютинации используют корпускулярные антигены (суспензии бактерий, эритроцитов).

— Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие 0-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.

— Агглютинация с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Реакция ставится с разными разведениями исследуемой сыворотки для определения титра антител. Нарастание титра специфических антител в сыворотке больного говорит об инфекционном заболевании. Это реакции титрования иммунной сыворотки, реакции Видаля для диагностики брюшного тифа, реакции Райта для диагностики бруцеллеза и др.

Также реакциия агглютинации применяется для определения группы крови по система AB0, с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки против антигенов групп крови А (II), В (III). Контролем служат: сыворотка, не содержащая антител, т.е. сыворотка АВ (IV) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эритроциты группы О (I).

3.Какие модификации позволяют повысить чувствительность реакции агглютинации?  

Для повышения специфичности и чувствительности реакции можно сделать разведения исследуемой сыворотки с доведением до её титра или половины титра.

Титр сыворотки-это максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титра, тем достовернее результаты реакции.

Также используют макроскопическую (развёрнутую) агглютинацию в пробирках, микроскопическую (ускоренную) ориентировочную агглютинацию на стекле, реакции непрямой (пассивной) гемаагглютинации.

4. Что такое диагностикум, для чего он применяется? Как приготовить О- Н- и Vi-диагностикумы и антительный диагностикум?

Диагностикум-препарат, содержащий взвесь обезвреженных микроорганизмов или определенных антигенов.

Их применяют в диагностических целях для обнаружения антител в сыворотке крови больных, реконквалесцентов и бактерионосителей.

В серологических реакциях для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы.

О-диагностикумы готовят из неподвижных сероваров культур, полученных при выращивании на плотных питательных средах и обработанных спиртом или глицерином. Применяются для выявления О-антител при сальмонеллезных инфекциях в реакции агглютинации с сывороткой больных.

Сальмонеллёзные Н-диагностикумы готовят из бульонных или агаровых культур путём добавления к ним формалина (не более 0,1- 0,3 % его концентрации). Используются в реакции агглютинации для определения заболевания в прошлом (анамнестическая реакция агглютинации) и реже с диагностической целью.

Vi-антиген, т.к. он обладает малой устойчивостью к различным воздействиям, в том числе и к формалину. Vi-диагностикум готовится из поверхностных |компонентов микробных клеток, стабилизируется 25 % раствором хлорида кальция и консервируется формалином. Применяется в реакции агглютинации при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства.

Антительный диагностикум применяют в РОНГА, т.к. могут адсорбировать на сеснибилизированных эритроцитах не только антигены, но и специфические антитела.

5. В чем заключается методика постановки реакции агглютинации на предметном стекле и развернутой  реакции в пробирках?

На одну половину предметного стекла нанести каплю диагностической сыворотки в разведении 1/10, на другую - каплю физиологического раствора (контроль). Петлей взять исследуемую культуру с МПА и внести ее сначала в каплю с физиологическим раствором, потом в каплю с иммунной сывороткой. Покачивая стекло, равномерно распределить ингредиенты реакции. Склеивание происходит в течение первых минут наблю- дения, когда при покачивании стекла в мутной капле образуются хлопья (зернышки), которые укрупняясь, перемещаются к периферии. В контрольной капле остается равномерная муть. 

Поскольку родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, это затрудняет их идентификацию. Поэтому из агглютинирующих сывороток удаляют групповые антитела путем адсорбции их родственными бактериями (р.Кастеллани). В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только для одного вида микроорганизмов. Полученные таким способом сыворотки называют монорецепторными адсорбированными диагностическими сыворотоками.

Агглютинирующую сыворотку добавляют в первую пробирку и затем переливают 1 мл разведенной сыворотки во 2 пробирку, затем из 2 в третью и т.д. Из 5 пробирки удаляют 1 мл смеси (в дез.р-р) для сохранения определенного объема. Штатив с пробирками помещаем в термостат на 2 часа, после чего учитываем предварительный результат. Окончательный результат учитывается через 24 часа, после пребывания реакции при комнатной температуре.

При отсутствии агглютинации жидкость остается равномерно мутная, при полной агглютинации образуются хлопья агглютината в прозрачной жидкости.

Последнее разведение принимают за титр агглютинирующей сыворотки, в которой происходит агглютинация.

6.Что такое коагглютинация, когда она применяется?

Коагглютинация-это реакции для определения антигенов с помощью антител, адсорбированных на белке А-клеток стафилококка.

Белок-А имеет сродство к Fc–фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой неспецифически адсорбируют антитела сыворотки, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.

7. Как ставится реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации, ее сущность, постановки, методика  постановки, практическое применение.  

В реакции непрямой гемагглютинации выявляют антитела сыворотки крови больного с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами.

Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде «пуговки».

РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

При помощи РПГА определяют полные (бивалентные) антитела.

Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум — эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум-реакция обратной непрямой гемагглютинации — РОНГА.

8.Реакция Кумбса для выявления неполных антител, ее сущность.

Эту реакцию применяют для выявления неполных или блокирующих антител, который образуются при патологических состояниях: резус-конфликте, аутоиммуных заболеваниях (системная красная волчанка, полиартирит), при некоторых хронических инфекционных заболеваниях (бруцеллёзе).

Для постановки реакции необходима антиглобулиновая сыворотка, которую получают путём иммунизации кролика человеческим глобулином. В них содержатся антитела ко всем глобулинам человека, а также к неполным антителам.Одна молекула иммуноглобулина АГС будет реагировать с двумя молекулами неполных антител, в результате чего произойдёт видимая реакция, по которой можно судить о присутствии неполных антител в исследуемой сыворотке.

9.Реакция преципитации: ингредиенты, их характеристика, механизм, методы постановки, практическое использование.

Реакция преципитации – это осаждение высокодисперсных антигенов (в коллоидном состоянии) - специфическими антителами (преципитинами) в присутствии электролита.

Выпадение нерастворимого комплекса антиген-антитело в виде осадка наблюдается, если эти ингредиенты находятся в эквивалентных количествах. Антиген в реакции преципитации должен быть прозрачным.

Реакцию преципитации ставят с целью выявления антигена по известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела.

Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.

Для приготовления коллоидных антигенов, участвующих в реакции преципитации, используют различные методы их экстракции из исследуемого материала: физические, химические и биологические. Бактериальный антиген может быть получен путем его экстрагирования из чистых культур бактерий, из патологического материала или из объектов внешней среды, обсемененных микробами (диагностика сибирской язвы, чумы, туляремии).

В судебно-медицинской практике с помощью реакции преципитации определяют видовую специфичность белка (крови, спермы), в санитарной практике - выявляют фальсификацию пищевых продуктов, в клинической иммунологии - уровень имунноглобулинов в сыворотке крови. В санитарной практике определяют фальсификацию рыбных и мясных изделий. В биологии используется для установления степени филогенетического родства различных видов животных и растений.

При постановке реакции приципитации разводят не сыворотку, а антиген. За титр преципитирущей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии со стандартной иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата.

10. Техника постановки реакции кольцепреципитации. В каких случаях она применяется?

Реакция кольцепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2—0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1—0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Учет реакции производят через 1—2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется.

Применяют для определения видовой специфичности белка крови.

11. Сущность реакции преципитации в агаре. В чем преимущество преципитации в агаре по сравнению с кольцепреципитацией?

Реакция преципитации в геле (агаре), в чашки заливают агаром, в котором выркзают нескольчко луночек на равном расстоянии друг от друга. В центральную лунку вносят сыворотку, содержащую антитела, в остальные испытуемые антигены или один и тот же антиген в различных разведениях. При диффузии реагентов в агаре в зонах оптимальных соотношений на месте встречи антигена и антител образуются мутные полосы-дуги преципитации.

В геле (агаре) данная реакция позволяет определить токсигенность исследуемых бактерий с помощью антитоксической сывороткой.

В чашку Петри помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Затем чашку подсушивают в термостате и засевают испытуемыми культурами в виде штрихов на расстонии 0,6-0,8 см от ее края. Контролем выступает токсигенная культура. Чашки инкубируют при 37°С в течении суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации в виде дуг.

12. Понятие об иммуноэлектрофорезе. сущность, применение. °

Иммуноэлектрофорез преждставляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле с иммунодиффузией.

Принцип ИЭФ состоит в электрофоретическом разделении белков (смеси антигенов) в забуференном агаровом геле. Затем в канавку, которая идёт параллельно направлению миграции белков, вносят прециптирующую сыворотку. Антигены и антитела диффундируют на встречу дург другу, где на их месте образуются дугообразные линии преципитации.

С помощью ИЭФ анализируют белки сыворотки крови, спиномозговой жидкости, мочи, белки микробного происхождения.В клинической практике используют для диагностики иммунодифицитных состояний, проявляющихся гаммаглобулинемией.