Что называется чистой культурой, штаммом и колонией микроорганизмов?

Дата 12.05

ГруппаА21

Дисциплина Микробиология, санитария и гигиена.

Тема: Посев разведений из прогретой и непрогретой пробы свекловичной стружки (диффузионного сока) с целью определения количества мезофильных и термофильных микроорганизмов. Посев разведений оборотной воды на плотные питательные среды

Культура микроорганизмов — это популяция (расплодка) клеток на питательной среде. Посев и пересев культур микроорганизмов на питательные среды — наиболее частый методический прием, который используют для первичного выделения микроорганизма из какого-либо объекта, а также для поддержания культур в жизнеспособном состоянии в лабораторных условиях.

Чистая культура — это популяция бактерий одного вида или биологического варианта (биовара), выращенная на питательной среде.

Штаммы — чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделенные из разных объектов или из одного и того же объекта, но в разное время.

Колония — макроскопически видимое скопление клеток микроорганизма на поверхности или внутри плотной питательной среды, образовавшихся в результате размножения одной жизнеспособной клетки. По этой причине колонию обычно рассматривают как чистую культуру микроорганизма.

Посев на плотную питательную среду. Выполняют разными способами.

При посеве в пробирку: 1) пробирки с засеваемой микробной культурой и питательной средой (МПА) берут в левую руку, пробирку с МПА держат скошенной поверхностью среды вверх. В открытую у пламени пробирку с микробной культурой (или другим материалом) вводят простерилизованную бактериологическую петлю, слегка прикасаясь петлей к поверхности среды (материала), берут материал, переносят его в пробирку со стерильной питательной средой. Петлю опускают до дна пробирки, погружают в конденсационную жидкость и зигзагообразным движением проводят снизу вверх по поверхности среды (посев «штрихом») (рис. 38). Пробирки закрывают пробками, петлю прожигают. Пробирки с посевами ставят в термостат; 2) при посеве уколом в столбик среды пробирку с плотной (нескошенной) средой берут в левую руку, над пламенем горелки извлекают из пробирки пробку, петлей с материалом прокалывают вертикально по центру пробирки питательную среду, петлю вынимают, прожигают, пробирку с засеянной средой закрывают пробкой (рис. 39).

При посеве на чашку Петри: чашку берут в левую руку, большим пальцем левой руки слегка приподнимают крышку, обжигают на пламени горелки края чашки в зоне щели, вносят посевной материал на поверхность питательной среды, затем растирают его при помощи стеклянного шпателя или бактериологической петли (рис. 40).

Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объёма исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного определения микроорганизмов, проведенного по методу Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных, так называемых колониеобразующих единицах (КОЕ).

Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений; посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

1. Приготовление разведений. Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде, жидкой питательной среде или в 0,85%-м растворе NaCl (физиологическом растворе). Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 см³ в стерильные сухие пробирки. Затем 1 см³ исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 см³ стерильной воды – это первое разведение (10^-1). Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, несколько раз вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную суспензию клеток. Затем той же пипеткой отбирают 1 см³ суспензии и переносят во вторую пробирку, получая второе разведение (10^-2). Таким же образом готовят последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.

Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата вследствие высокой способности клеток микроорганизмов к сорбции на поверхности стекла.

2. Посев. Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную агаризованную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15 – 20 см³ в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. В чашку Петри с подсушенной средой вносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 см³) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2 – 4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1; 0,5 или 1,0 см³) исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 45 – 50 °С среду, тщательно перемешивают, затем немедленно выливают в чашку Петри и дают среде застыть. В случае глубинного посева пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом. По 1 см³ из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2 – 4 стерильные чашки Петри. Затем заливают в чашки по 15 – 20 см³ среды, расплавленной и остуженной до 45 – 50°С, и смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. Когда среда застынет, чашки Петри в перевернутом виде помещают в термостат.

Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри после посева помещают в анаэростат.

3. Подсчет выросших колоний. Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 1 – 15 сут инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.

Лучшим разведением следует считать то, из которого при высеве в чашке Петри вырастает от 30 – 50 до 100 – 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке (рис.3).

Рис. 3. Схема приготовления разведений и высева в чашки Петри

Количество клеток в 1 см³ исследуемого субстрата вычисляют по формуле:

M =

где M – количество клеток в 1 см³; a – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения; V – объем суспензии, взятый для посева, см³; 10ⁿ – коэффициент разведения.

Задание 1.Изучите содержание темы и ответьте на вопросы

1.Что называется чистой культурой, штаммом и колонией микроорганизмов?

2. Как определяют количество микроорганизмов методом Коха?